一种中药组合物在制备减少间质干细胞凋亡的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物应用领域，具体涉及一种中药组合物的用途。
【背景技术】
[0002]干细胞移植在再生医学的研究中是一个理想的方法，因为干细胞很容易获得，具有多向潜力和免疫优势。此外在，在急性心肌梗死后，干细胞用来修复和再生受损心肌。然而，相关的临床试验表明，干细胞疗法只是略有改善心脏功能。一个主要原因是心肌梗塞的微环境是有害的，如氧化应激和炎症，这可能导致细胞死亡和损害的治疗潜力。例如，Mangi等发现骨髓msc移植后3个月和7天之间彻底死亡。大部分的干细胞移植要在7天内治疗。因此，如何促进移植干细胞烦人存活是一个重要的问题，骨髓间质干细胞治疗作为改善血管功能和增强心肌再生的一种治疗方法被越来越多的人所关注。然而，在急性心肌梗死中这种治疗方法被限制了，因为大多数的移植细胞在恶略的微环境下死亡了。因此，我们要努力提高骨髓间质干细胞的存活率。
[0003]AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以调节能量平衡和作为能量的传感器，激活AMPK可以促进能量的产生和限制能量的使用，从而可以确保细胞的存活。eNOS是AMPK通路的一个下游因子，激活它可以提高NO的生成。AMPK/eNOS通路在调节细胞凋亡方面的作用已经有所研究。然而，它的作用在本发明药物诱导的间质干细胞存活方面还没有被证实。在缺氧和低灌注状态下(H / SD)培养细胞可以模拟在体外急性心肌梗死的微环境，并诱导间质干细胞的凋亡。因此，我们设计实验是为了调查:(I)在体外的缺氧和低灌注状态下下本发明药物是否能够减少间质干细胞的凋亡；(2) AMPK/eNOS通络是否参与了本发明药物抗间质干细胞的凋亡作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种中药组合物在制备减少间质干细胞凋亡的药物中的应用。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
一种中药组合物在制备减少间质干细胞凋亡的药物中的应用，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
人参5-9水蛭5-11 土鳖虫6-9制乳香2-4赤芍4_7降香2_4檀香2_4全蝎3-7蝉蜕6-10蜈蚣1-3冰片2-6炒酸枣仁4-9。
[0006]所述应用为该中药组合物具有激活AMPK/eNOS通路的作用。
[0007]所述应用为该中药组合物具有保护线粒体的完整性的作用。
[0008]所述应用为该中药组合物具有降低Bax蛋白表达或增加Bcl-2的表达的作用。
[0009]所述应用为该中药组合物具有降低细胞色素C的表达的应用。
[0010]所述中药组合物的活性成分由下列成分组成: a平均粒径小于100 Mffl的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉； b冰片药粉；
c由降香和檀香提取的挥发油； d人参用乙醇提取后的醇提液经浓缩后的醇提浸膏；
e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸枣仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓缩成的水提浸膏。
[0011]该中药组合物的制剂剂型为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。
[0012]所述胶囊剂是由以下步骤制成的:
a)按照重量份比例称取各原料药；
b)药材粉碎工艺:
将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上；粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于100 Mffl;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；
c)提取浓缩和干燥工艺:
降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和炒酸枣仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏；
d)制剂工艺:
在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。
[0013]优选的，该中药组合物由如下重量份的原料药制成:
人参6水蛭11 土鳖虫7 制乳香2 赤芍5 降香2 檀香2全蝎3 蝉蜕7 蜈蚣I 冰片5炒酸枣仁5。
[0014]或
人参9水蛭5 土鳖虫6制乳香2赤芍7 降香4 檀香4全蝎4 蝉蜕6 蜈蚣2 冰片6 炒酸枣仁9。
[0015]为验证所述中药组合物的效果，用实施例1制得的胶囊作了以下实验:
材料和方法
本实验是严格按照中国对实验动物的管理和使用指导方针执行的。所有的动物都接受了人文关怀和由阜外医院实验动物委员会批准的实验协议。
[0016]细胞分离和培养
骨髓来自SD大鼠^0_80g，雄性)的胫骨和股骨，放于装有培养基(Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基[MDM，Gibco公司，美国]，10%胎牛血清[Gibco公司，美国]和1%青霉素-链霉素[Gibco公司，美国])的细胞培养瓶中。将培养瓶置于37°C的含有5%C02 -95%空气温度培养箱中。24小时后将非贴壁细胞用PBS液冲洗掉。此后2-3天换一次培养液，当细胞融合到80%的时候，用0.25%胰蛋白酶EDTA (Gibco公司，美国)分离，并按1:2的比例传代培养。实验中用到的细胞均为3代细胞。
[0017]本发明药物溶液的制备
将本发明药物内容物(以岭药业，河北，中国)溶解在MDM培养基中，溶液超声溶解10分钟，2500转离心15分钟，收集上清液。在无菌条件下用0.22 μ m过滤器获得无菌溶液。将沉淀物干燥，收集起来计算本发明药物的实际溶解量。溶液的终浓度调至2000 μ g/ml，存储在4°C环境下备用，在图中，本发明药物组用TXL表示。
[0018]细胞的处理
为了检测本发明药物对间质干细胞的保护作用，将间质干细胞用PBS冲洗2次，然后暴露于37°C的缺氧和不同浓度的本发明药物(50 μ g/mL, 100 μ g/mL, 200 μ g/mL, 400μ g/mL)的无血清MDM液环境中6小时。为了进一步阐明潜在的机制，在培养基中添加PBS液之前用AMPK抑制剂(Calb1chem，Germany) 10 μ M将细胞进行预孵化。为了保持相同的时效，将正常组的间质干细胞在正常条件下(5%C02，95%空气)培养基中培养。
[0019]为了引起缺氧，将细胞放置在一个密封的，装有催化剂(B1-Me’arieux)的缺氧GENbox罐中以清除自由氧。同时,在罐中有一个anaer指示器(B1Me’arieux)用于检测氧张力。
[0020]形态变化的评估
用相差显微镜和荧光显微镜检查间质干细胞的形态。凋亡间质干细胞的特点是细胞收缩和染色质凝聚。染色体缩合评估使用Hoechst 33342 (Beyotime公司，中国)染料。在室温下将细胞用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS液冲洗2次，然后暴露于室温下5 μ g/ml Hoechst 33342染料中30分钟。最后，被染色的细胞用PBS液冲洗2次后用荧光显微镜(Leica, Germany)成像。
[0021]断裂的检测
原位DNA片段检测-TUNEL试剂盒(碧云天，中国)，按照说明书进行操作。将处理后的细胞用低聚甲醛固定30分钟，在冰上，用0.1%的TritonX-1OO 2分钟，在室温下混合I小时，然后用TUNEL检测。最后细胞荧光染色，显微镜(Leica，德国)下进行成像。将细胞用绿色荧光标定为凋亡细胞。
[0022]细胞凋亡的流式细胞术
细胞凋亡的流式细胞术分析，根据AnnexinV-FITC/PI试剂盒说明书进行操作。干细胞是从板上移开并重新悬浮于200微升的结合缓冲液。然后，将10 μ L的膜联蛋白V溶液加入到细胞中，在室温下，孵育30分钟,然后加入300微升的结合缓冲液和5μ L的ΡΙ。使用FACSCalibur流式细胞仪进行细胞染色，利用Quest软件(BD，USA)进行数据分析。
[0023]线粒体膜电位的测量
根据电压敏感荧光染料JC-1说明书的指示，进行线粒体膜电位(MMP)测定。将细胞放在6孔板中培养,将显不的化合物进行处理并孵育,放在0.5ml完全培养基中,在37°C环境中把0.5mL的JC-1染色溶液放置20分钟，然后用JC-1染色缓冲液冲洗两次。最后，将细胞重悬浮于300 μ L染色缓冲液并通过流式细胞术分析。从每个样品中MMP染色的值被表示为通过绿色荧光强度的红色荧光强度的比值。和线粒体去极化是由在红色/绿色荧光强度比的降低指示
蛋白样品制备和免疫印迹分析
PBS冲洗两次后，将培养的细胞从培养瓶中刮下并收集在冰上的印pendorf管中，加入裂解物，在4°C以13000rpm离心15分钟，取上清液并冷冻于_80°C直到使用。利用BCA蛋白测定法进行总蛋白的定量。
[0024]用30微克蛋白上样，使用12% SDS-PAGE分离，使用半干电印迹装置(B1-Rad公司，美国)，电泳后将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上，将膜放入5%脱脂奶粉在室温下封闭I小时。将膜在4°C孵育过夜，分别用第一抗体如下:细胞