一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法
【专利说明】一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学提取领域，尤其涉及一种超声辅助提取大青叶中靛蓝和靛玉红的 方法。 【【背景技术】】
[0002] 大青叶属常用的叶类中药，是十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.)的 干燥叶，性大寒、味苦；具有凉血消斑、利咽止痛、清热解毒之功效，所含化学成分主要包括 色氨酸、棕榈酸、靛蓝、靛玉红、腺甙、色胺酮、谷留醇、Y-谷留醇等，临床上主要用于治 疗流行性乙型脑炎、上呼吸道感染、流行性感冒等病毒性、感染性疾病。随着大青叶有效成 分及药理活性的逐步明确，其临床应用也日益受到重视。靛蓝和靛玉红是大青叶的主要活 性成分，具有抗菌、保肝等活性，而靛玉红对于慢性粒细胞白血病也具有较好的疗效。
[0003] 索氏提取是用溶剂将植物药材长期浸润而将所需要的物质浸出来的一种提取方 法，此法花费时间长、溶剂用量大、效率不高。
[0004] 响应面法（RSM)的原理是利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程拟合因素 与响应值之间的函数关系，通过对函数响应面和等高线的分析，寻求最优工艺参数，解决多 变量优化问题。响应面法的最大优点在于试验次数少、预测性好、精度高。该法已广泛地应 用于生物、食品、化学等领域。目前，利用响应面法来优化大青叶中靛蓝和靛玉红的超声辅 助提取工艺尚未见报道。 【
【发明内容】
】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的问题，提供一种提取效率高的超声辅助提 取大青叶中靛蓝和靛玉红的方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
[0007] 首先取干燥的大青叶粉末与体积分数为55~95%的甲醇溶液混合，大青叶粉末 和甲醇溶液的料液比为Ig : (10~50)mL，然后进行超声辅助提取，得到靛蓝和靛玉红的总 提取液，总提取液过滤后浓缩至干，得到提取物靛蓝和靛玉红。
[0008] 进一步地，所述的大青叶粉末是通过大青叶在40~60°C的恒温干燥箱中处理至 恒重，然后粉碎并过20~60目筛得到的。
[0009] 进一步地，超声功率为400~600W。
[0010] 进一步地，提取的温度为20~60°C。
[0011] 进一步地，提取的时间为15~55min。
[0012] 进一步地，大青叶粉末和体积分数为80%的甲醇溶液按料液比为Ig :34mL进行混 合，在41°C超声辅助提取25min。
[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0014] 本发明以大青叶为原料，应用超声辅助提取法制备靛蓝和靛玉红，超声波能在短 时间内使大青叶的细胞破碎，释放出细胞中的有效成分靛蓝和靛玉红，提取用时短；同时， 本发明通过采用体积分数为55~95%的甲醇溶液，与靛蓝和靛玉红极性相近，利于靛蓝和 靛玉红的充分溶出，同时能够避免醇溶性杂质的溶出量增加；本发明大青叶粉末和甲醇溶 液通过采用Ig : (10~50)mL的料液比，在超声波使大青叶细胞破裂，使得有效成分不断溶 出时，利于靛蓝和靛玉红的扩散，同时能够保证超声波的穿透能力，传质效率高，产生协同 效应，从而有效提高靛蓝和靛玉红的提取效率，验证结果表明，本发明制备得到的靛蓝和靛 玉红的最大提取效率分别为112. 72%和116. 42%，其综合评分为101. 87,与综合评分理论 值（99.25)基本吻合，提取效率高、能耗低，且操作简便，具有安全、简单、快速等优点，能够 有效提高大青叶靛蓝和靛玉红的利用率，具有良好的开发应用前景，为合理有效地利用菘 蓝资源提供了依据。
[0015] 进一步，本发明中通过在20~60°C下进行提取，此时分子运动速率较快，有利于 细胞内靛蓝和靛玉红的溶出，同时能够保证靛蓝和靛玉红的化学结构完整性，而且还能避 免溶剂甲醇挥发。 【【附图说明】】
[0016] 图1为靛蓝标准工作曲线图；
[0017] 图2为靛玉红标准工作曲线图；
[0018] 图3为甲醇浓度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；
[0019] 图4为提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；
[0020] 图5为料液比对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；
[0021] 图6为提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率的影响；
[0022] 图7(a)为甲醇浓度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响 的响应面图，图7(b)为甲醇浓度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分 影响的等尚线图；
[0023] 图8(a)为甲醇浓度和料液比对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响的 响应面图，图8(b)为甲醇浓度和料液比对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响 的等尚线图；
[0024] 图9(a)为甲醇浓度和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响 的响应面图，图9(b)为甲醇浓度和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分 影响的等尚线图；
[0025] 图10(a)为料液比和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响 的响应面图，图10(b)为料液比和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影 响的等尚线图；
[0026] 图11 (a)为料液比和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影响 的响应面图，图11(b)为料液比和提取温度对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影 响的等尚线图；
[0027] 图12(a)为提取温度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评分影 响的响应面图，图12(b)为提取温度和提取时间对大青叶中靛蓝和靛玉红提取效率综合评 分影响的等高线图。 【【具体实施方式】】
[0028] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0029] 一、材料与试剂
[0030] 大青叶（购自陕西省道地中药材有限公司），经西北濒危药材资源开发国家工程 实验室鉴定为十字花科（Cruciferae)菘蓝属（Isatis)植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.)的干燥叶；
[0031] 靛蓝和靛玉红标准品（购自中国药品生物制品检定所，会99. 9% );
[0032] 甲醇、二甲基亚砜（DMSO)均为分析纯。
[0033] 二、仪器设备
[0034] 手提式粉碎机（温岭市林大机械有限公司，型号：DFT-50);分析天平（赛多利斯 科学仪器有限公司，型号：BSA1245) ;SHB-HIA循环水式多用真空泵（陕西太康生物科技有 限公司）；超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB25-12DTD) ;RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LC-2010A HT高效液相色谱仪（日本SHIMADZU)
[0035] 三、靛蓝和靛玉红的提取步骤
[0036] (1)大青叶的处理
[0037] 将大青叶在40~60°C的恒温干燥箱中处理12h至恒重，粉碎并过20~40目筛， 得到大青叶粉末；
[0038] (2)提取
[0039] 将步骤（1)处理好的大青叶粉末与体积分数为55%~95%的甲醇溶液按照料液 比（g/mL) 1:10~1:50进行混合，在提取温度20°C~60°C条件下，进行超声辅助提取15~ 55min，超声功率为400~600W，得到靛蓝和靛玉红总提取液。
[0040] 四、靛蓝和靛玉红的测定：
[0041] 标准曲线的确定
[0042]1、靛蓝标准曲线的绘制
[0043] 精确称取10.0 mg靛蓝标准品，加入少量二甲基亚砜（DMSO)溶液助溶，用甲醇 溶液定容至10.0 mL，配制成1.0 mg/mL的母液；将母液稀释成浓度分别为0. 0004、0. 002、 0. 01、0. 051、0. 1、0. 15、0. 2、0. 25mg/mL的靛蓝标准溶液，各进样5. 0 y L，以进样量为横坐 标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程：Y = 4. 2X 106X+675. 71，R2= 0. 9998,线性范围为： 0.002~1.25 yg，靛蓝标准曲线如图1所示。
[0044] 2、靛玉红标准曲线的绘制
[0045] 精确称取10.0 mg靛玉红标准品，加入少量DMSO溶液助溶，以甲醇溶液定容至 10.0 mL，配制成1.0 mg/mL的母液；将母液稀释成浓度分别为0. 0008、0. 004、0. 02、0. 1、0. 2、 0. 3、0. 4mg/mL的靛玉红标准品溶液，各进样2. 0 y L，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标， 得线性回归方程：Y = 6. 7 X 106X+2238. 7, R2= 0. 9996,线性范围为：0. 00016 ~0. 8 y g，靛 玉红标准曲线如图2所示。
[0046] 制备好的供试液用0? 22 y m微孔滤膜过滤后，吸取I. 5mL于进样瓶中，在289nm波 长下利用HPLC法检测靛蓝与靛玉红的吸收峰面积，计算样品中靛蓝和靛玉红的含量，并与 索氏提取法进行比较，计算提取效率。
[0047] 以下通过具体实施例和对比例对本发明做进一步详细说明。
[0048] 对比例：索氏提取法
[0049] 大青叶药材于60°C下干燥至恒重，经粉碎后过40目筛，精密称取三份，每份 〇. 50g，置于索氏提取器中；用80%的甲醇溶液在80°C水浴中提取8h，滤液滤过，滤液减压 浓缩至干，用75%的甲醇溶液定容至10mL，低温避光保存，待测。本发明拟定索氏提取中靛 蓝和靛玉红的提取效率为100%，并以此为参照，计算超声辅助提取所获靛蓝和靛玉红的提 取效率。
[0050] 实施例：超声辅助提取法
[0051] 精确称取干燥至恒重且过20~40目筛的大青叶粉末0.50g于50mL离心管中，超 声辅助提取，提取液滤过；滤液减压浓缩至干，用75%的甲醇溶液定容至10mL，低温避光保 存，待测。
[0052] 首先进行单因素实验，以靛蓝和靛玉红的提取效率为响应值，分别研宄甲醇浓度 (55%、65%、75%、85%、95% )，提取时间（151^11、25111111、35111111、45111111、55111111)，料液比&/ mL) (1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)，提取温度（20°C、30°C、40°C、50°C、60°C )对靛蓝和靛玉 红提取效率的影响。在单因素实验中，对其中一个因素进行探讨时，其余各因素分别为：甲 醇浓度为75%，料液比为1:30,提取时间为25min，提取温度为40°C，超声功率为600w。
[0053] 实施例一甲醇浓度对靛蓝和靛玉红提取效率的影响