青钱柳有效部位在制备防治非酒精性脂肪肝药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及青钱柳提取物及其有效部位的新用途，尤其涉及青钱柳有效部位在制 药领域的新用途，确切地说是制备防治非酒精性脂肪肝药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮 酒史而以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床综合征。它是目前最常见的慢性肝 病。其基本病程包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纤维化，最终可能发展成脂肪性 肝硬化及脂肪性肝癌，可能导致过早的死亡。全球约有20~40%的NAFLD患者，且数量在 不断上升并呈现低龄化趋势。NAFLD是肝脏对代谢综合征的反应，与肥胖、二型糖尿病、心血 管疾病的发病息息相关，肥胖症患者NAFLD患病率为65~95%，2型糖尿病患者NAFLD患 病率为28~55%和27~92%。因NAFLD发病具有隐匿性、迀延性、普遍性，且其病变的危 害性较大，故对其病防治成为世界专业人士努力的方向。
[0003] 改变生活方式，干预饮食和运动能有效控制NAFLD，被普遍推荐用以疾病的初级阶 段的改善，但实施有困难，往往无法达到预期的效果，且对肝纤维化，肝硬化患者疗效不明 显。因此，有效的药物治疗必不可少。临床常通过增加胰岛素敏感、改善胰岛素抵抗（如类 双胍，噻唑烷二酮类），降低血脂（他汀类，贝特类），抗氧化（维生素E)来治疗非酒精性脂 肪肝，但因这些药物或存在副作用，或加剧肝脏负担，或药效欠佳，使用上受到限制。目前尚 未有批准的治疗NAFLD药物。因此，开发安全有效的NAFLD治疗药物和保健产品具有重要 的创新意义及临床使用价值。
[0004]青钱柳（Cyclocarya paliurus Batal.)为胡桃科（Juglandaceae)青钱柳属植 物，广泛分布于江西、广西等地。它是一种高大速生落叶乔木，叶甘甜滋润，能生津止渴、清 热解暑。长期以来民间用青钱柳叶作茶汤，当地人民长寿，鲜有代谢类疾病，称之为"甜茶"、 "神茶"，可见青钱柳具有多种对人体有益的生理活性和药理功能，且无毒副作用。以青钱柳 为原料生产的保健茶是我国第1个获得美国FDA认可的保健茶。近年来，国内外学者对青 钱柳的理化成分及保健功能在动物水平及临床试验初步研宄，表明青钱柳及相关保健产品 具有多种有益的药理作用和保健效果，包括降压、降血糖、减肥、抗肿瘤、抗过敏、增强机体 免疫、抑菌等作用。研宄发现，青钱柳能显著改善机体脂质代谢，起到降低体重、改善血脂和 减少肝脏脂滴的作用，且具有良好的抗炎抗氧化活性，提示青钱柳可能对NAFLD的发生发 展起到积极的防治作用。
【发明内容】
[0005] 本发明针对NAFLD的治疗现状，提出一种青钱柳提取物有效部位的新用途，即 在制备防治非酒精性脂肪肝药物中的应用，青钱柳有效部位能有效改善高脂饲料导致的 NAFLD大鼠肝脏脂质水平，对肝脏起到保护作用，为非酒精性脂肪肝的防治提供了安全高效 的选择。
[0006] 本发明所涉及的有效部位是从植物青钱柳中提取获得的，该总有效部位中总三萜 的含量为5~100%，可按照各种文献所记载的方法制备得到，这些都是本领域技术人员所 熟知的技术。此外，青钱柳有效部位也可通过各种商业途径购买得到，主要含以下一种或几 种：
[0015] 其制备方法优选为，包括下列步骤：
[0016] (1)提取：青钱柳叶干燥药材经0% -100%乙醇或者甲醇（C1-C5脂肪醇）作溶剂 提取，合并提取液，过滤，浓缩。
[0017] 上述提取方法可为：加热回流、浸渍、渗漉、超声等多种方法。
[0018] (2)纯化：该浓缩液通过有机溶剂（石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等）萃取、 S印hadex LH-20、大孔树脂、硅胶等手段纯化。
[0019] 本发明还提供青钱柳其有效部位与药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药 学上常用的制剂。
[0020] 本发明提供的以青钱柳提取物或其有效部位为原料制得的新药，不仅包括单方制 剂，还包括在复方制剂中添加青钱柳有效部位作为活性成分的保健品和药物。
【附图说明】：
[0021] 图1.青钱柳有效部位高效液相图谱
[0022] 图2.青钱柳有效部位对高脂大鼠肝脏相对脂质水平的影响
[0023] 图3.青钱柳有效部位对高脂喂养大鼠肝脏脂质积累的影响
[0024] 实施例1 :青钱柳有效部位的制备
[0025] 1.青钱柳有效部位的制备
[0026] 青钱柳干燥叶1kg，经80 % (体积/体积）乙醇8L回流提取3次，每次2h，合并提 取液，过滤，回收溶剂得浸膏。浸膏加适量水混悬后，用I. 5倍量氯仿萃取3次，回收溶剂得 青钱柳提取物。其中三萜的百分含量为10%-80% (重量/重量）。
[0027] 2?总三萜含量的测定：
[0028] 标准品的制备：精密称取齐i敦果酸标准品5mg，用无水乙醇配制得浓度为0.1 mg/ mL的母液。再各取母液1.0~5. OmL，分别用无水乙醇定容至10mL。吸取上述稀释后的对 照品溶液各lmL，挥干溶剂，加入5 %香草醛-冰醋酸0. 4mL和高氯酸0. 8mL，混合均匀，于 80°C水浴中加热IOmin后迅速冷却，最后加入5mL的冰醋酸，于550nm处测吸光度值。空白 对照样品制备：仅依次加与标准品相同浓度的香草醛-冰醋酸、高氯酸及冰醋酸各0. 4、0. 8 和5mL。以浓度对吸光度绘制标准曲线，并计算标准回归方程。
[0029] 样品中总三萜含量的测定：精密称定5g的青钱柳叶精制三萜酸粉末5mg于50mL 容量瓶中，无水乙醇溶解并稀释至刻度线，即得样品液。吸取样品液lmL，挥干溶剂，按标准 曲线项下方法一式六份测定吸光度值（Abs)，计算得总三萜的含量。
[0030] 3. HPLC 分析
[0031] 青钱柳有效部位部位样品适量，溶于分析级甲醇中，用微孔滤膜过滤得到lmg/mL 浓度的样品溶液。本实验的色谱条件为：采用Alltima C18 column C18色谱柱（5 ym， 4. 6mmX 250mm)以乙腈为流动相A，水-0. 02%甲酸为流动相B ;采用A-B混合流动相梯度 洗脱：0 ~20min，50 % A ;20 ~22min，50 % ~53 % A ;22 ~40min，53 % A ;40 ~55min， 53%~100%4;55~601^11，100%4。流速为11111^111111-1，柱温271：，检测波长为 20511111， 进样量10yL。通过与标准品比较其保留时间确定色谱峰，（1)阿江榄仁酸（arjunolic acid)，（2)青钱柳酸 B(cyclocaric acid B)，（3)pterocaryoside B，（4)3 0，23_ 二轻 基-12-稀-28-乌苏酸（3 0，23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid)，（5)常春藤阜苷元 (hederagenin)，（6)齐壤果酸（oleanolic acid)(如图 1)。
[0032] 实施例2:青钱柳有效部位对NAFLD的改善作用
[0033] 1?材料
[0034] I. 1动物
[0035] 健康雄性SD大鼠，180~220g，SPF级，购自南通大学实验动物中心，许可证号： SCXK (SU 12014-000)〇
[0036] 1. 2药物与试剂
[0037] 青钱柳有效部位粉末，溶解于适量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，配制一定浓度的溶 液备用。辛伐他汀购自宜昌市长沙药业有限公司。甘油三酯（TG)、总胆固醇（TC)、非酯化 脂肪酸（NEFAs)、谷丙转氨酶（ALT)、谷草转氨酶（AST)、碱性磷酸酶（ALP)、丙二醛（MDA)检 测试剂盒购自南京建成生物工程研宄所。大鼠TNF-a Elisa试剂盒购自南京森贝伽生物技 术有限公司。<