一种白头翁提取物及其在制备防治肺纤维化药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种白头翁提取物及其在制备防治肺纤维化 药物中的应用。 二、
【背景技术】：
[0002] 肺纤维化是一种严重威胁人类健康和生命的恶性疾病。目前治疗肺纤维化的药 物主要包括糖皮质激素类、免疫抑制剂和细胞毒类药物。少部分接受糖皮质激素治疗的患 者显示出一定的疗效，但没有完全或持续缓解者，副作用严重、长期疗效不能确定等问题制 约了这些药物的长期应用。提高药物的疗效一直是广大医药工作者追求的目标。随着对肺 纤维化发病学研宄的日益深入，已经证实细胞外基质（ECM)中胶原蛋白、弹性纤维以及蛋 白糖类的过量堆积是其特征性的病理组织学变化。目前，认为成纤维细胞的增殖和活化是 ECM大量形成和堆积的主要原因，肺泡上皮细胞的间质转化、成纤维细胞的增生是成纤维细 胞的主要来源。在有害刺激、细胞因子等的作用下，成纤维细胞活化，分泌大量的ECM。尽管 对肺纤维化的发病机制有了更深入的认识，但临床治疗仍然不佳。
[0003] 中药能够在一定程度上改善肺纤维化终末期患者的生活质量，但也存在药理作用 机制和作用靶点不明确问题。因此，开发作用靶点明确、毒副作用小、长期服用安全可靠的 抑制肺纤维化中药，具有重要的意义。
[0004] 白头翁是毛茛科白头翁Pulsatilla chinensis(Bge. )Regel的干燥根，是常用的 一种中药材。白头翁苦、寒。入归胃、大肠经。具有清热解毒、凉血止痢的功效。临床用于 热毒血痢，里急后重，湿热带下，温疟寒热；以及大便脓血、肠癌、腹泻及多种感染等。白头翁 提取物具有抗菌、抗阿米巴原虫和滴虫、抗肿瘤、抗组织胺、镇静镇痛等药理作用。目前，发 现白头翁含药血清在体外可有效抑制人肺巨细胞癌细胞株PG细胞的生长，具有一定的细 胞毒性作用；白头翁水提取物或醇提取物对包括肺癌在内的多种肿瘤体内、体外具有抑制 作用，除细胞毒作用外，还与诱导凋亡、抑制血管生成、抑制肿瘤细胞增殖等有关。另有研宄 发现，白头翁皂苷的酶解产物可明显促进皮肤纤维芽细胞的胶原蛋白合成。某些用于呼吸 系统疾病的中药组合物中含有白头翁，这些组合物可用于多种呼吸系统疾病，涉及支气管 哮喘、急性支气管炎、肺脓肿、病毒性肺炎、老年肺炎、肺癌和间质性肺炎。也有一些来自于 白头翁的单一化学成分可用于肺癌等治疗的报导。尚未发现白头翁提取物具有防治肺纤维 化的研宄报道。 三、
【发明内容】
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[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供一种白头翁提取物及其在制备防治肺纤维化药 物中的应用。白头翁提取物通过抑制肺成纤维细胞的增殖、抑制肺泡上皮细胞向间质细胞 的转化，从而防治肺纤维化的形成和发展，使其在制备防治肺纤维化药物中得到新的用途。
[0006] 本发明提供一种白头翁提取物，所述白头翁提取物是通过以下方法提取得到：
[0007] a、以白头翁为原材料，加入白头翁重量6~10倍的体积百分含量50~95%的乙 醇，然后置于闪式提取器中进行提取；将每次所得提取液过滤，合并滤液；所得剩余滤渣待 用；将所得滤液减压浓缩至比重为1. 05~I. 10的浸膏；浓缩后的滤液采用石油醚进行萃 取，萃取后弃去石油醚液，下层水液挥去石油醚，将所得溶液在50~60°C下浓缩至相对密 度为1. 10~130的稠膏，减压干燥得到白头翁总皂苷粗品；
[0008] b、将步骤a待用的剩余滤渣中的乙醇蒸除，然后加入蒸馏水，所得滤渣与蒸馏水 的重量比为1 :8~16,加入蒸馏水后浸泡20~30min，浸泡后加热煎煮提取2~3次，每次 100~120分钟；每次煎煮提取后进行过滤，所得滤液合并；将所得滤液减压浓缩至比重为 1. 10~1. 20的浸膏，离心20~30分钟，离心后所得上清液中加入乙醇使乙醇含量达到体 积浓度为60~90%，乙醇边加入边搅拌，4~6°C条件下静置12h，然后离心倾去上清液，收 集沉淀；采用无水乙醇洗涤所得沉淀，然后离心除去上清液，所得下层沉淀中再加入丙酮进 行洗涤、离心；离心后所得沉淀中再加入乙醚洗涤、离心，所得沉淀挥干乙醚，得到白头翁多 糖；
[0009] C、将步骤a得到的白头翁总皂苷粗品和白头翁多糖混合均匀，得到白头翁提取 物。
[0010] 根据上述的白头翁提取物，a中所述提取：其提取2~3次，每次提取时间为1~ 5min ;所述萃取，其萃取次数为2~3次。
[0011] 根据上述的白头翁提取物，C中所述白头翁总皂苷粗品和白头翁多糖混合均匀，所 述混合时总皂苷粗品和多糖的混合质量比为1~3:1。
[0012] 另外，提供一种上述白头翁提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。
[0013] 根据上述的白头翁提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，白头翁提取物在制 备防治肺纤维化药物中应用时，采用白头翁提取物或以白头翁提取物为主要成分的药物组 合物。
[0014] 根据上述的白头翁提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，所述白头翁提取物 或者以白头翁提取物为主要成分的药物组合物，按照药学常规方法制成片剂、胶囊剂、颗粒 剂、丸剂、滴丸剂、散剂、口服液、糖浆剂或酒剂。
[0015] 为了更好的理解本发明的实质性内容，以下结合白头翁提取物的药理试验实例及 其结果，说明白头翁提取物在制备防治肺纤维化疾病药物中的用途。
[0016] 实验例1 :白头翁提取物对人胚肺成纤维细胞（MRC-5)增殖的影响
[0017] 1)材料与方法:MRC-5细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。MEM培养 基（武汉博士德生物工程有限公司）、胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）。白头 翁提取物：总皂苷和多糖按照质量比例1. 5:1混合均匀，备用。
[0018] 3. 0 X IO3的MRC-5细胞加入到96孔板的板孔中，培养24h。吸出原培养液，加入含 有不同浓度（12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL、50 μ g/mL、100 μ g/mL 和 200 μ g/mL)的白头翁提取物 的完全培养液，以加入不含提取物的完全培养液作为正常对照。继续培养，分别在24h、48h 和72h，胰酶消化，显微镜下计数板计数细胞。
[0019] 2)实验结果：详见表1。在48h和72h，与正常组（0组）比较，100yg/mL、200 yg/ mL的白头翁提取物组细胞数量显著减少（P〈0. 05-0. 01)。
[0020] 表1白头翁提取物对两种细胞增殖的抑制作用（lOVmL，
[0021]
[0022] a'b，与正常组（0 组）比较，aP〈0. 05, bP〈0. 01。
[0023] 3)实验结论：白头翁提取物对MRC-5肺成纤维细胞的增殖有抑制作用。
[0024] 实验例2 :白头翁提取物对肺泡上皮细胞（A549)上皮-间质转化的影响
[0025] 1)材料与方法：A549细胞来自于中国科学院上海生科院细胞资源中心。 RPM1-1640培养基（Beijing Solarbio Science&Technology Co. Ltd)、胎牛血清（浙江天杭 生物科技股份有限公司）、Human TGF-β? (Pepro Tech Inc)出-妈粘蛋白抗体（E-cadherin Antibody;货号 BA0475)、α-平滑肌肌动蛋白抗体（a smooth muscle actin(a-SMA) Antibody ;货号BM0002)、即用型SABC-POD (小鼠 IgG)试剂盒（货号SA1021)、即用型 SABC-POD(兔IgG)试剂盒（货号SA1022)均为武汉博士德生物工程有限公司产品。白头翁 提取物，总皂苷和多糖按照质量比例1. 5:1混合均匀，备用。
[0026] 在24孔培养板的每个孔中加入玻璃片，然后在每个玻璃片上加入IX IO4细胞。将 培养板放入5% C02、37°C培养箱中，使细胞贴壁于玻璃片。2h取出培养板，更换不含血清的 RPM1-1640培养液，继续培养8h。吸除培养液，加入新的培养液；分为5组，即正常组（加入 RPM1-1640完全培养液）、TGF- β 1刺激组简称TGF- β 1组（加入含有5ng/mL TGF- β 1的 RPM1-1640完全培养液）、药物干预组（加入含有5ng/mL TGF-β 1的RPM1-1640完全培养 液，培养液分别含有12. 5 μ g/mL、25 μ g/mL、50 μ g/mL的白头翁提取物），继续培养48h。
[0027] E-cadherin和a -SM检测：取出细胞培养液后，每孔加入lmL、4%的多聚甲醛液， 37°C固定20min。PBS溶液洗涤，分别进行E-cadherin和a -SMA免疫细胞化学染色。分析 上述蛋白表达，结果以阳性表达的累积光密度数值（IOD)/细胞的面积（Area)表示。
[0028] 2)实验结果：详见表2。肺泡上皮-间质转化的特征性表现，是细胞特异性蛋白表 达的变化，即上皮细胞特异性蛋白E-cadherin表达量的减少，以及间质细胞特异性蛋白如 a -SMA表达量的增加。与正常组比较，TGF-β 1组E-cadherin显著降低（P〈0. 01)，a -SMA 显著升高（Ρ〈0. 01)。与TGF-β 1组相比，12. 5、25和50 μ g/mL白头翁提取物组E-cadherin 显著升高（Ρ〈0· 001)，a -SMA 显著降低（Ρ〈(λ 01-0. 001)。
[0029] 表2白头翁提取物对TGF- β 1诱导Α549细胞上皮-间质转化的影响?±s )
[0030]
[0031] ο'。，TGF-β 丨组比较，aP〈0. 05, bP〈0. 01，cK0.00 1。
[0032] 3)实验结论：TGF- β I诱导A549肺泡上皮细胞转化成间质细胞，白头翁提取物对 该转化过程有抑制作用。
[0033] 综上所述，本发明所涉及的白头翁提取物具有防治肺纤维化的作用，具有制备防 治肺纤维化药物的潜力及实际推广价值。 四、【具体实施方式】：
[0034] 实施例1 :
[0035] 本发明白头翁