轭合方法
【专利说明】轭合方法
[0001] 本申请是申请日为2010年06月02日和发明名称为"轭合方法"的 201080024325. 3号发明专利申请的分案申请。
[0002] 本申请要求2009年6月3日提交的美国临时申请号61/183,774的优先权，其完 整公开内容在此明确通过引用并入。 发明领域
[0003] 本发明涉及使效应基团（例如，细胞毒性剂）或报道基团（例如，放射性标记）与 细胞结合剂例如抗体或其片段通过双官能连接体轭合的新方法。更具体地，本发明涉及使 效应基团（例如，美登木素生物碱）或报道基团（例如，放射性标记）与细胞结合剂（例如 抗体或其片段）通过双官能连接体轭合的新方法，使得该过程消除了导致由于分子内或分 子间反应而生成的不期望的水解物类或不期望的交联物类生成的步骤。
[0004] 发明背景
[0005] 细胞结合剂例如抗体与效应基团例如小细胞毒性剂或细胞毒性蛋白的轭合物 在开发抗癌治疗剂方面引起浓厚兴趣（Richart，A. D.和Tolcher，A. W.，2007, Nature Clinical Practice，4,245-25)。这些轭合物由于针对肿瘤细胞的细胞表面上表达的抗原 所选择的抗体的高特异性而是肿瘤特异性的。当特异性结合至肿瘤细胞时，抗体-细胞毒 性剂轭合物被内化入靶癌细胞并在其中降解，由此释放抑制必要细胞功能例如微管动力学 或DNA复制的活性细胞毒性剂，导致癌细胞的杀伤。已经采用各种连接体连接抗体与细胞 毒性剂，目的是增强内化时细胞内物质的递送和轭合物的加工，同时保持轭合物在血浆中 期望的稳定性。这些连接体包括被设计具有不同程度的空间位阻而影响其分子内硫醇还 原动力学的二硫化物连接体、可裂解的肽连接体例如缬氨酸-瓜氨酸连接、和不可裂解连 接体例如硫酿连接（Widdison，W.等，J. Med. Chem.，2006,49,4392-4408 ;Erickson，H.等， Cancer Res·，2006,66,4426-4433)〇
[0006] 细胞结合剂例如抗体与标记或报道基因的轭合物用于癌症患者的肿瘤成像应用、 诊断各种疾病的免疫测定应用、使用放射性核素-配体轭合物的癌症疗法、和纯化生物活 性剂例如蛋白、肽和寡核苷酸的亲和色谱应用。与细胞结合剂轭合的标记或报道基因包括 荧光团和亲和标记例如生物素。
[0007] 经由不可还原的连接（例如硫醚连接）连接的细胞结合剂例如抗体（Ab)与效应 基团（例如，细胞毒性剂）或报道基团（例如，放射性标记）的常规轭合方法采用两个不同 的抗体反应步骤，并必须使用纯化步骤。在第一反应步骤中，抗体与带有两个不同反应性 基团（例如，X和Y)的异双官能连接体反应。例如，在一种方法中，抗体的反应性残基（例 如赖氨酸氨基残基）与异二双官能试剂的X反应性基团（例如N-羟基琥珀酰亚胺酯）的 反应导致在抗体的一个或多个反应性残基（例如赖氨酸氨基残基）处加入具有Y反应性基 团的连接体。最初修饰的抗体产物必须在可以发生下一步骤之前从过量连接体或水解连接 体试剂纯化。在第二反应步骤中，含有Y反应性基团（例如马来酰亚胺或卤代乙酰胺）的 连接体修饰的抗体与含有反应性基团例如硫醇的效应物例如效应基团（C)(例如，细胞毒 性剂）反应生成抗体-效应物轭合物，其在额外纯化步骤中再次纯化（参见例如，美国专利 5, 208, 020、5, 416, 064或5, 024, 834)。因此，在以上方法中，需要至少两个纯化步骤。
[0008] 包括两个反应和纯化步骤以轭合抗体与效应基团或报道基团的另一种方法利用 抗体中的硫醇残基（通过用硫醇生成试剂例如2-亚胺基硫烷修饰抗体或者通过诱变加入 非天然半胱氨酸残基或者通过还原天然二硫键而产生）与含有Y反应性基团（例如马来酰 亚胺或卤代乙酰胺）的同双官能连接体Y-L-Y反应。
[0009] 在抗体或肽中加入反应性基团Y例如马来酰亚胺（或卤代乙酰胺）的主要缺点是 反应性马来酰亚胺（或卤代乙酰胺）基团与抗体或肽中天然组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱 氨酸残基经历分子内或分子间反应（Papini，A.等，Int. J. Pept. Protein Res.，1992, 39， 348-355 ;Ueda，T.等，Biochemistry，1985, 24,6316-6322)，以及 Y 马来酰亚胺基团的水性 失活。在与效应基团或报道基团C的第二反应之前，抗体中加入的马来酰亚胺（或卤代乙 酰胺）基团Y与抗体中天然组氨酸、赖氨酸或半胱氨酸残基的不期望的分子内或分子间反 应以及Y马来酰亚胺基团的水性失活产生交联蛋白或不均一轭合物并降低与效应基团或 报道基团C的第二反应的效率。不均一轭合物产物一由于最初加入的基团Y(例如马来酰 亚胺基团）与抗体或肽中天然基团（例如组氨酸、赖氨酸、酪氨酸或半胱氨酸）的不期望反 应或水性失活产生的无活性马来酰亚胺残基而产生的交联蛋白或肽一可能具有比期望的 均一轭合产物差的活性和稳定性。
[0010] 之前已经描述了通过二硫键轭合抗体与含硫醇细胞毒性剂的方法（参见例如，美 国专利 5, 208, 020、5, 416, 064、6, 441，163,美国专利公开号 2007/0048314 Al)。这些方法 包括抗体与异双官能试剂的最初反应，随后与含硫醇细胞毒性剂的第二反应。已经在美国 专利6, 441，163 Bl中描述了可选方法，其中细胞毒性剂的二硫化物连接的反应性酯首先被 纯化，然后与抗体反应，但是该方法在抗体反应步骤之前包括从含硫醇基细胞毒性剂开始 的额外的反应和纯化步骤。
[0011]目前制备细胞结合剂轭合物的方法的其他缺点是需要两个纯化步骤，这两个纯化 步骤降低了总产率，并且还使该方法对于放大生产而言变得繁琐和不经济。
[0012] 鉴于以上所述，本领域需要开发制备细胞结合剂-药物轭合物组合物的改良方 法，所述细胞结合剂-药物轭合物组合物具有很高纯度并且其制备不需要繁琐步骤并减少 了用户的时间和成本。本发明提供了这种方法。本发明的这些和其他优点以及其他发明特 征将根据本文提供的发明描述而变得明显。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明描述了用于制备式C-L-CBA的不可还原的硫醚连接的轭合物的轭合方法， 其中C代表效应分子或报道分子（例如，细胞毒性剂或放射性标记），L是连接体，CBA是细 胞结合剂（例如，抗体或其片段），通过利用含硫醇细胞毒性剂（例如，美登木素生物碱）与 异或同双官能试剂（例如，可裂解或不可裂解的连接体）的直接反应，随后混合未纯化的反 应混合物与细胞结合剂（例如，抗体或其片段），由此通过更有效、高产率且容易放大的工 艺产生不可还原的硫醚连接的轭合物。另一个重要的优点是这种轭合方法产生无链间蛋白 交联或失活残基（例如，马来酰亚胺或卤代乙酰胺残基）的硫醚连接的不可还原的轭合物。 本说明书公开的新方法可用于制备由上式表示的任何轭合物。
[0015] 具体地，本发明涉及以下各项：
[0016] 1. -种在溶液中制备纯化的轭合物的方法，其中所述轭合物包括与细胞结合剂连 接的效应分子或报道分子，所述方法包括以下步骤：(a)使所述效应分子或报道分子与双 官能连接体试剂接触以共价连接所述连接体与所述效应分子或报道分子并由此制备包含 具有与之连接的连接体的所述效应分子或报道分子的未纯化的第一混合物，（b)通过所述 未纯化的第一混合物与细胞结合剂反应而使所述细胞结合剂与具有与之连接的连接体的 所述效应分子或报道分子轭合以制备第二混合物，和（c)使所述第二混合物经受正切流动 过滤、透析、凝胶过滤、吸附色谱、选择性沉淀或其组合以由此制备纯化的轭合物。
[0017] 2.如第1项所述的方法，其中步骤（b)在pH约4至约9的溶液中进行。
[0018] 3.如第1项所述的方法，其中步骤（b)的第二混合物基本上不含由于分子内或分 子间反应而生成的不期望的交联的、水解的物类。
[0019] 4.如第1项所述的方法，其中所述效应分子是细胞毒性剂。
[0020] 5.如第4项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱、紫杉烷、CC1065 或其类似物。
[0021] 6.如第4项所述的方法，其中所述细胞毒性剂是美登木素生物碱。
[0022] 7.如第6项所述的方法，其中所述美登木素生物碱包含硫醇基。
[0023] 8.如第6项所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DMl。
[0024] 9.如第6项所述的方法，其中所述美登木素生物碱是DM4。
[0025] 10.如第1项所述的方法，其中所述细胞结合剂是干扰素、白介素2 (IL-2)、白介素 3 (IL-3)、白介素 4 (IL-4)、白介素 6 (IL-6)、胰岛素、EGF、TGF- a、FGF、G-CSF、VEGF、MCSF、 GM-CSF、运铁蛋白或抗体。
[0026] 11.如第10项所述的方法，其中所述细胞结合剂是抗体。
[0027] 12.如第11项所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
[0028] 13.如第11项所述的方法，其中所述抗体是人或人源化单克隆抗体。
[0029] 14.如第10项所述的方法，其中所述抗体是ΜΥ9、抗B4、EpCAM、⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、 CD6、CD11、CD19、CD20、CD22、CD26、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD56、CD79、CD105、 CD138、EphA 受体、EphB 受体、EGFR、EGFRvIII、HER2、HER3、间皮素、cripto、α νβ 3、α νβ 5、 α νβ 6整联蛋白或C242。
[0030] 15.如第13项所述的方法，其中所述人或人源化抗体是My9-6、Β4、C242、Ν901、 DS6、EphA2受体、CD38、IGF-IR、CNTO 95、B-B4、曲司珠单抗、帕妥株单抗、比伐珠单抗、西罗 珠单抗或利妥昔单抗。
[0031] 16.如第1项所述的方法，其中所述连接体是可裂解或不可裂解的连接体。
[0032] 17.如第1项所述的方法，其中所述报道分子是放射性同位素。
[0033] 附图简述
[0034] 图1显示了抗体与美登木素生物碱DMl (或DM4)和马来酰亚胺-PEGn-NHS连接体 的反应混合物的轭合。
[0035] 图2显示使用本发明描述的方法制备的Ab- (PEG4-Mal) -DM4轭合物与使用传统两 步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有10 yg蛋白；凝胶用考马斯蓝染 色。泳道1和2含有分子量标志物。泳道3含有通过传统两步方法制备的具有6.1 DM4/Ab 的轭合物。泳道4含有通过本发明描述的方法制备并且含有6. 2 DM4/Ab的轭合物。
[0036] 图3显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal) -DM4轭合物与使用传统 两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A.Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物在还原条件下 的蛋白 LabChip 电泳（Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 试剂盒）。泳道 1 :分子量标记物；泳道2 :使用本发明描述的方法合成的Ab-PEG4_Mal_DM4,6. 2 D/Ab ;泳道 3 :使用两步轭合方法合成的Ab-PEG4-Mal-DM4,6. I D/Ab ;泳道4 :未轭合的Ab (每条泳道 0. 24微克总蛋白）。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记 物。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。
[0037] 图4显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(PEG4-Mal)-DM4轭合物与使用传统 两步方法制备的轭合物的MS。A.通过传统两步方法制备的具有6.1 DM4/Ab的轭合物的 MS。由于轭合物的明显不均一性，MS峰不能良好分辨。B.通过本发明描述的方法制备并含 有6. I DM4/Ab的轭合物的MS。由于轭合物的均一性，MS峰被良好分辨。
[0038] 图5显示了具有6. 7 DMl/抗体的抗CanAg抗体-PEG4-Mal-DMl轭合物（使用本发 明描述的方法制备）对表达CanAg抗原的C0L0205细胞的结合与未修饰抗体对表达CanAg 抗原的C0L0205细胞的结合。结合使用荧光单位测量。
[0039] 图6显示了具有6. 7 DMl/抗体的抗CanAg抗体-PEG4-Mal-DMl轭合物（使用本发 明描述的方法制备）对表达CanAg抗原的C0L0205细胞的体外细胞毒性。轭合物被添加至 C0L0205细胞，在与轭合物连续孵育5天之后，使用WST-8测定法测量细胞存活。使用过量 未轭合的抗CanAg抗体阻断轭合物对靶癌细胞的结合和细胞毒性来进行对照试验以说明 轭合物的特异性。
[0040] 图7显示抗体与DMl (或DM4)和马来酰亚胺-磺基-NHS连接体的反应混合物的 轭合。
[0041] 图8显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-MaD-DMl轭合物与使用传统 两步方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有10 yg蛋白；凝胶用考马斯蓝 染色。泳道1含有分子量标志物。泳道3和5含有通过本发明描述的方法制备并分别含有 3. 6/Ab和6. 2DM4/Ab的轭合物。泳道2和4含有通过传统两步方法制备并分别含有4. 0/ Ab和5. 7DM1/Ab的轭合物。
[0042] 图9显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(磺基-Mai)-DMl轭合物与使用 传统两步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A. Ab-(磺基-Mal)-DM1轭合物在还 原条件下的蛋白 LabChip 电泳（Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 试剂 盒）。泳道I :分子量标记物；泳道2 :未轭合的Ab ;泳道3 :使用两步轭合方法合成的Ab-磺 基-Mal-DMl，5. 7 D/Ab ;泳道4 :使用本发明描述的方法合成的Ab-磺基-Mal-DMl，5. 6 D/ Ab ;每孔0. 22微克总蛋白。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外 部标记物（每孔0.24微克总蛋白）。B.来自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。
[0043] 图10显示了通过本发明描述的方法制备的抗体_(磺基-MaD-DMl轭合物与通过 传统两步轭合方法制备的轭合物的LC-MS比较。A.使用本发明描述的方法制备的具有3. 6 DM1/Ab的轭合物的MS显示具有1-6 DMl分离轭合物峰的均一轭合物。B.通过传统两步轭 合方法制备的具有4. 0 DM1/Ab的轭合物的MS显示对应于轭合物以及具有水解或交联连接 体的轭合物（例如具有2 DMl的轭合物，加一个L、两个L和三个3L)的峰，表明不均一的产 物。
[0044] 图11显示了具有5. 6 DMl/抗体的抗CanAg抗体-磺基-Mal-DMl轭合物（使用 本发明描述的方法制备）对表达CanAg抗原的C0L0205细胞的结合与未修饰抗体对表达 CanAg抗原的C0L0205细胞的结合。结合以荧光单位测量。
[0045] 图12显示了具有5. 6 DM4/抗体的抗CanAg抗体-磺基-Mal-DMl轭合物（使用 本发明描述的方法制备）对表达CanAg抗原的C0L0205细胞的体外细胞毒性。轭合物被添 加至C0L0205细胞，在与轭合物连续孵育5天之后，使用WST-8测定法测量细胞存活。使用 过量未轭合的抗CanAg抗体阻断轭合物对靶癌细胞的结合和细胞毒性来进行对照试验以 说明轭合物的特异性。
[0046] 图13显示抗体与DMl (或DM4)和磺基-NHS SMCC连接体的反应混合物的轭合。
[0047] 图14显示使用本发明描述的方法制备的Ab-(SMCC)-DMl轭合物与使用传统两步 方法制备的轭合物的还原SDS-PAGE。每个样品泳道含有10 yg总蛋白；凝胶用考马斯蓝染 色。泳道1含有分子量标志物，泳道2含有未轭合的Ab，泳道3含有通过传统两步方法制备 的具有3. I DM1/Ab的轭合物，泳道4含有通过本发明描述的方法制备的具有3. I DM1/Ab 的轭合物。
[0048] 图15显示了使用本发明描述的方法制备的Ab-(SMCC)-DMl轭合物与使用传统两 步方法制备的轭合物的蛋白LabChip电泳。A. Ab-SMCC-DMl轭合物在还原条件下的蛋白 LabChip 电泳（Agilent 2100 Bioanalyzer/Agilent Protein 230 试剂盒）。泳道 1 :分子 量标记物；泳道2 :使用本专利描述的方法合成的Ab-SMCC-DM1，3. I D/Ab ;泳道3 :未轭合 的Ab ;泳道4 :使用两步轭合方法合成的Ab-SMCC-DMl，3. I D/Ab ;(每个泳道含有0. 24微克 总蛋白）。较高标记物、系统峰和较低标记物条带代表从试剂盒添加的外部标记物。B.来 自蛋白LabChip电泳的蛋白条带的定量。
[0049] 图16显示了通过本发明描述的方法制备的抗体-(SMCC)-DMl轭合物与通过传统 两步轭合方法制备的轭合物的LC-MS比较。A.通过连续两步方法制备的具有3. I DM1/Ab 的轭合物的MS。