升，多10升，多20升，多50升，多100升，多250升等。
[0116] -旦形成水包油乳液，其可转移到无菌玻璃瓶内。玻璃瓶的大小可以是5、8、或10 升。或者，水包油可以转移到无菌柔性袋（柔性袋）内。柔性袋的大小可以是50、100、或 250升。另外，柔性袋可接上一个或多个无菌接头以连接柔性袋与系统。使用装有无菌接头 的柔性袋与玻璃瓶相比是有利的，因为柔性袋比玻璃瓶更大，意味着不需要更换柔性袋来 储藏一批中制备的全部乳液。这可为乳液制备提供无菌的密闭系统，从而可减少存在于最 终乳液中的杂质几率。如果最终乳液用于药物学目的，例如如果最终乳液是MF59佐剂，这 就特别重要。
[0117] 最终乳液中油的含量（体积％ )优选为2-20 %，例如约10 %。约5 %或约10 %的 鲨烯含量特别有用。30-50mg/ml的鲨烯含量（w/v)是有用的，例如35-45mg/ml，36-42mg/ ml, 38_40mg/ml 等。
[0118] 最终乳液中表面活性剂的优选量（重量％ )为：聚氧乙烯山梨醇酯（例如吐温 80)0. 02-2%，特定是约0.5%或约1% ;去水山梨醇酯（例如司盘85)0. 02-2%，特定是 约0.5%或约1% ;辛基或壬基苯氧基聚氧乙醇（例如曲通X-100)0. 001-0. 1%，特定是 0.005-0. 02%;聚氧乙烯醚（例如月桂醇聚醚9)0. 1-20%，优选0. 1-10%，特定是0. 1-1% 或约0. 5%。聚山梨醇酯80含量（w/v)在4_6mg/ml时有用，例如4. 1-5. 3mg/ml。去水山 梨糖醇三油酸酯含量（w/v)在4-6mg/ml时有用，例如4. 1-5. 3mg/ml。
[0119] 该方法对于制备任何下列水包油乳液特别有用：
[0120] ?含有鲨烯、聚山梨酯80 (吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯（司盘85)的乳液。 该乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0. 5%聚山梨酯80和约0. 5%去水山梨糖醇三油酸 酯。以重量计，这些含量变为4. 3%鲨烯、0. 5%聚山梨酯80和0. 48%去水山梨糖醇三油酸 酯。这种佐剂称为'MF59'。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如IOmM柠檬酸钠缓冲液。
[0121] ?包含鲨烯、α-生育酚（理想的是DL-α-生育酚）和聚山梨酯80的乳液。这 些乳液可含有（重量计）2-10%鲨烯，2-10% α生育酚和0.3-3%聚山梨酯80,例如4.3% 鲨烯、4.7% α-生育酚、1.9%聚山梨酯80。鲨烯：生育酚的重量比优选<1(例如0.90)， 因为这提供了更稳定的乳液。鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2,或者重量比约为 11:5。可通过以下方法制备一种这类乳液：将聚山梨酯80溶解于PBS产生2%溶液，然后 将90ml该溶液与5g DL- α -生育酚和5ml角鲨烯的混合物相混合，然后使该混合物微流体 化。得到的乳液可含有如尺寸为100_250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
[0122] ?鲨烯、生育酚和曲通去污剂（如曲通X-100)的乳液。该乳液也可含有3-0-脱酰 化单磷酰脂质A( '3d-MPL'）。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
[0123] ?含有鲨烯、聚山梨酯（如聚山梨酯80)、曲通去污剂（如曲通X-100)和生育酚 (如琥珀酸α-生育酚）的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如 75(^ 8/!111聚山梨酯80、11(^8/1111曲通父-100和10(^8/1111琥珀酸€1-生育酚），且这些浓 度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液也可包含3d-MPL。该乳液也可包含皂苷，如QS21。 所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
[0124] ?含有鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂（如聚氧乙烯 (12)十六十八醚）和疏水性非离子型表面活性剂（如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如 去水山梨糖醇单油酸酯或'司盘80'）的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90% 油滴（以体积计）的尺寸小于200nm[40]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低 温保护剂（例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖）；和/或烷基聚糖苷。也可包含TLR4 激动剂，如化学结构不含糖环的TLR4激动剂[41]。这类乳液可冻干。
[0125] 如上以百分数表示的这些乳液的组合物可通过稀释或浓缩来改变（例如可以改 变整数倍，如2或3倍，或改变部分，例如2/3或3/4)，其中其比例保持不变。例如，2倍浓 缩的MF59可包含约10%鲨烯，约1 %聚山梨酯80和约1 %去水山梨糖醇三油酸酯。可稀释 浓缩形式（例如用抗原溶液），得到所需的乳液终浓度。
[0126] 本发明的乳液理想地储存在2°C -8°C。其不应冷冻。它们应理想地避直射光保存。 特别是本发明含鲨烯的乳液和疫苗应当受到保护以避免鲨烯的光化学分解。如果储存本发 明的乳液，那么优选在惰性气体，例如氮气或氩气中。
[0127] 疫苗
[0128] 虽然可能将水包油乳液佐剂本身给予患者（如为单独给予患者的抗原提供佐剂 效应），但更常见的是将佐剂与抗原混合后形成免疫原性组合物例如疫苗，然后给予患者。 可以在临用前或者在疫苗生产过程中混合乳液和抗原。，然后装填。本发明的方法可用于两 种情况。
[0129] 因此，本发明方法还可包括将乳液与抗原组分混合的工艺步骤。或者，还可包括将 佐剂与抗原组分一起包装到药盒中作为药盒组分的步骤。
[0130] 因此，综上所述，制备混合的疫苗时或制备包含易混合抗原和佐剂的药盒时，可使 用本发明。如果在生产过程中混合，那么所混合的散装抗原和乳液的体积一般大于1升，例 如彡5升、彡10升、彡20升、彡50升、彡100升、彡250升等。如果在使用时混合，那么所混合 的体积一般小于1毫升，例如< 0. 6mK 0. 5mK 0. 4mK 0. 3mK 0. 2ml等。在这两种 情况下，通常混合的乳液和抗原溶液的体积基本相等，即基本上为1:1 (例如I. 1:1-1:1. 1， 优选1.05:1-1:1. 05,更优选1.025:1-1:1.025)。然而，在一些实施方式中，可采用过量的 乳液或过量的抗原[42]。当一种组分的体积过量时，过量通常为至少1.5:1，例如>2:1、 >2. 5:1、>3:1、>4:1、>5:1 等。
[0131] 抗原和佐剂作为药盒中的单独组分时，它们在药盒中物理上相互分离，这种分离 可通过多种方式实现。例如，组分可以装在不同的容器，如药瓶中。需要时，可通过（例如） 取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三 个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。
[0132] 在另一种配置中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使 用该注射器（例如装有针头的注射器）将其内含物注入药瓶中混合，然后将该混合物抽回 注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合内容物给予患者。将一种组 分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。
[0133] 在另一优选配置中，这两种药盒组分在同一注射器中但分开保存，例如双室注射 器，如参考文献43-50等所述。操作注射器时（例如给予患者时），将这两室中的内容物混 合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。
[0134] 不同药盒组件的内容物通常均为液体形式。在一些配置中，组分（一般是抗原组 分而非乳液组分）是干燥形式（例如冻干形式），而另一组分是液体形式。可将这两种组分 混合，以再次激活干燥组分，得到给予患者的液体组合物。冻干组分一般置于药瓶中，而非 注射器中。干燥组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混 合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置使用预填装注射器中的液态乳液组分和药 瓶中的冻干抗原组分。
[0135] 如果疫苗还含有乳液和抗原以外的组分，那么这些其它组分可包含在这两种药盒 组分之一中，或者可以是第三种药盒组分的一部分。
[0136] 适用于本发明混合疫苗或单独药盒组分的容器包括药瓶和一次性注射器。这些容 器应无菌。
[0137] 组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入 药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳 塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。在一个实施方式中，药瓶具有丁基橡皮塞。药 瓶可包含单一剂量的疫苗/组分，或者可以包含一个以上剂量（'多剂量'药瓶），如10个 剂量。在一个实施方式中，药瓶包含IOx 〇. 25ml剂量的乳液。优选的药瓶由无色玻璃制成。
[0138] 药瓶可以有适合的帽（如鲁尔（Luer)锁），以便将预填装注射器插入该帽，可以 将注射器的内容物推入药瓶（如在其中重建冻干物质），可以将药瓶的内容物移回注射器 中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子 内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。
[0139] 将组合物/组分包装到注射器中时，注射器通常不会连接有针头，但可提供注射 器单独的针头以组装和使用。优选安全性针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和 5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感 季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时 偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注 射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器 和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。
[0140] 可用缓冲液稀释乳液，然后包装入药瓶或注射器。常用缓冲剂包括：磷酸盐缓冲 剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。稀 释可降低佐剂组分的浓度，而维持其相对比例，例如提供"半强度"佐剂。
[0141] 容器可标注有半剂量体积，以例如利于递送给儿童。例如，含有0. 5ml剂量的注射 器可标有0. 25ml体积的标记。
[0142] 采用玻璃容器（如注射器或药瓶）时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制 成的容器。
[0143] 各种抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于：病毒抗原，如病毒表面蛋白；细菌 抗原，如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生物抗原；和肿瘤抗原。本发明特别可用于针对 以下的疫苗：流感病毒、HIV、钩虫、乙肝病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、 巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、衣原体、SARS冠状病毒、水痘-带 状疱疹病毒、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria Meningitidis)、结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis)、炭疽杆菌（Bacillus anthracis)、EB病毒、人乳头瘤病毒等。例如：
[0144] ?流感病毒抗原。抗原可以采取活病毒或者灭活病毒的形式。采用灭活病毒时，该 疫苗可包含全病毒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原（包括血凝素，通常也包括神经氨酸 酶）。流感抗原也可以病毒体形式出现。所述抗原可具有选自下组的任何血凝素亚型：H1、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 / 或 H16。疫苗可包括来自一 种或多种（例如1、2、3、4或更多种）流感病毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒 的抗原，例如单价A/H5N1或A/H1N1疫苗或三价A/H1N1+A/H3N2+B疫苗。流感病毒可以是 重配毒株，并可通过逆向遗传学技术获得[如51-55]。因此，该病毒可包含来自A/PR/8/34 病毒（一般是来自A/PR/8/34的6个节段，HA和N节段来自疫苗毒株，即6:2重配毒株） 的一个或多个RNA节段。可以在鸡蛋（如含胚鸡蛋）或细胞培养物上培养用作抗原来源 的病毒。使用细胞培养物时，细胞底物一般是哺乳动物细胞系，如MDCK ;CH0 ;293T ;BHK ; Vero ;MRC-5 ;PER. C6 ;WI-38 ;等。用于培养流感病毒的哺乳动物细胞系优选包括：MDCK细 胞[56-59]，衍生自马达二氏（Madin Darby)犬肾；Vero细胞[60-62]，衍生自非洲绿猴肾； 或PER. C6细胞[63]，衍生自人胚视网膜母细胞。在哺乳动物细胞系上培养病毒时，该组合 物宜不含鸡蛋蛋白质（如卵清蛋白和卵类粘蛋白）和鸡DNA，从而降低变应原性。