一种伊枯草菌素a微胶囊剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种伊枯草菌素 A微胶囊剂的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 微胶囊技术是利用高分子材料把固体、液体或气体包覆成具有半透性或密封囊膜 的一种微型胶囊的技术。微胶囊具有能够改变物料的状态、质量、体积和性能，保护敏感成 分，增强稳定性，控制芯材释放，降低或掩盖不良味道、降低挥发性，隔离组分等功能，微胶 囊技术在食品、医药、纺织、涂料、农业、化妆品工业等方面得到广泛的应用。
[0003] 伊枯草菌素 A(iturin A)是由枯草芽胞杆菌产生的一种具有环脂肽结构的两亲化 合物，由7个氨基酸和1个β-氨基脂肪酸组成。iturin A含有3种同系物，分子量分别为 1043Da、1057Da和1071Da，它们的氨基酸序列相同，脂肪酸链长度依次相差-CH 2。iturin A 化学结构式如下：
[0004]
[0005] iturin A具有表面活性和强烈的抗真菌特性，并且具有抗菌谱广、稳定性好、低 毒、低残留和低过敏性的特点，其抗菌机制是同时作用于病原菌的细胞壁和细胞膜，是一种 潜在的具有极大开发应用价值的生物农药。
[0006] 目前，尚未见有关iturin A微胶囊剂的报道。本发明所述的iturin A微胶囊剂 具有良好的抗紫外线性能、控缓释性和贮存稳定性等，可延长iturin A抑菌时效性和保质 期，为iturin A微胶囊剂的农业应用提供技术支持。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种伊枯草菌素 A微胶囊剂的制备方法，利用该方法制备的 伊枯草菌素 A微胶囊剂，具有良好抗逆性、控缓释性和贮存稳定性。
[0008] 为了达到以上目的，本发明采用了以下技术方法：
[0009] -种伊枯草菌素 A微胶囊剂的制备方法，包括以下步骤：
[0010] 取200ml 1. 0% -2. 0% (质量百分比）的海藻酸钠水溶液，在40°C下，330-825r/ min磁力搅拌下缓慢加入20-50ml 120-130 μ g/ml伊枯草菌素 AQturin A)水溶液，相同条 件下搅拌20min后，缓慢加入200ml~800ml L 0% -2. 0% (质量百分比）的γ -聚谷氨 酸的水溶液，相同条件下持续搅拌5h后，15-30Mpa高压勾质10-15min，得到iturin A微胶 囊乳化液；
[0011] 将iturin A微胶囊乳化液，采用喷雾干燥技术制备iturin A微胶囊剂；
[0012] 喷雾干燥条件：进风温度为180 °C~200 °C，出风温度为90±5 °C，进料速度为 300ml/h〇
[0013] 如上所述的方案中，优选的海藻酸钠的质量百分比为I. 25% ;伊枯草菌素 A的质 量为3200 μ g ; γ -聚谷氨酸的质量百分比为1. 25% ;
[0014] 如上所述的方案中，优选的，磁力搅拌时，转速为495r/min ;喷雾干燥时，进风温 度为180°C。
[0015] 以上所述方案中，涉及的各类试剂或原料，均来源于商业渠道或已被公开制备方 法。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0017] 1.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂可以有效阻隔外界紫外线的不良影 响，iturin A微胶囊剂经与其相距30cm、30W紫外线照射36h后，iturin A保留率大于90%， 提高iturin A微胶囊剂的抗逆性。
[0018] 2.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂具有良好的控缓释性，微胶囊剂中 iturin A在第Id缓释速率很快，缓释率达到70 %左右；之后缓慢释放，在第6d微胶囊剂 中iturin A释放完全。iturin A微胶囊剂可持续缓释6d，具有良好的控缓释性，可延长 iturin A的抑菌时效性。
[0019] 3.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂，常温常压下，微胶囊中iturin A的 浓度在90d贮存期内没有显著变化，具有良好的贮存稳定性。
[0020] 4.利用本发明方法制备的iturin A微胶囊剂具有良好的分散性，呈球形，表面有 凹陷，粒径大小较均匀，直径约为1. 0-10. 0 μm。
【附图说明】
[0021] 图1为一种iturin A微胶囊剂的电镜扫描图
[0022] 图2为一种iturin A微胶囊剂的抗紫外线性能曲线示意图
[0023] X轴表示紫外照射时间（h)，Y轴表示iturin A保留率（％)。
[0024] 图3为一种iturin A微胶囊剂的缓释曲线示意图
[0025] X轴表示缓释时间（d)，Y轴表示iturin A缓释率（％)。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合具体的实施例和实验数据对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方 法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。
[0027] 实施例1 :
[0028] -种伊枯草菌素 A微胶囊剂的制备方法，包括以下步骤：
[0029] (1)微胶囊壁材水溶液的制备：
[0030] I.按照质量百分比，配制1. 25%的海藻酸钠水溶液，备用；
[0031] II.按照质量百分比，配制1.25%的γ-聚谷氨酸的水溶液，备用。
[0032] (2)微胶囊乳化液的制备：
[0033] 取200ml由步骤（1)制备得到的L 25%的海藻酸钠水溶液，在40°C下，495r/min 磁力搅拌下缓慢加入25ml，128 μ g/ml iturin A水溶液，相同条件下搅拌20min后，缓慢加 入步骤（2)制备得到的200ml 1. 25%的γ -聚谷氨酸的水溶液，持续搅拌5h，20Mpa高压匀 质（GYB30-6D型，上海东华高压勾质机厂）15min，得到iturin A微胶囊乳化液。
[0034] (3)将步骤⑵的iturin A微胶囊乳化液，采用喷雾干燥技术制备iturin A微胶 囊剂，用于以下实施例2-6。
[0035] 喷雾干燥条件：进风温度为180°C，出风温度为90°C，进料速度为300ml/h。
[0036] 所述海藻酸钠购自青岛明月海藻集团有限公司，规格为LN液相，批号为2#。
[0037] 所述的γ-聚谷氨酸是以左、右旋光性的谷氨酸为单元体，以γ-位上的醯胺键聚 合而成同质多肽（Homo-polypeptide)，聚合度约在1,000-15,000之间。
[0038] 所述的iturin A水溶液的制备：
[0039] 枯草芽胞杆菌菌株X-01(CCTCC NO :M 208067)保藏菌种在牛肉膏蛋白胨固体培 养基上划线，28°C恒温培养箱中培养24h，挑取单菌落接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中， 置于28°C、180rpm摇床培养24h，制备X-Ol种子液。向X-Ol发酵培养基中接种X-Ol种子 液，接种量为2%，置于28°C、180rpm摇床培养48h，发酵液离心（8000r/min、4°C、10min)， 取上清调pH至2. 0进行酸沉淀，置于4°C冰箱过夜，再离心（8000r/min、4°C、IOmin)，收集 沉淀，沉淀溶于纯水中，调pH至7. 0复性，再次离心（8000r/min、4°C、IOmin)，取上清即为 iturin A水溶液。
[0040] 实施例2 :
[0041] iturin A微胶囊剂的表观形态
[0042] 制样（离子溅射仪）一电镜扫描仪（SEM)观察
[0043] iturin A微胶囊剂电镜扫描图见图1。从图中可知，iturin A微胶囊剂具有良好 的分散性，呈球形，表面有凹陷，粒径大小较均匀，直径约为1. 0-10. 〇 μ m。
[0044] 实施例3 :
[0045] iturin A微胶囊剂的包埋率测定
[0046]
[0047] I.微胶囊剂中iturin A的提取
[0048] 0· 20g微胶囊剂加入IOml甲醇（色谱纯），37°C，160r/min摇床浸润4h后，超声 波处理40min，离心（8000r/min，4°C，IOmin)取上清I. 0ml，用过滤头过滤除菌2次，收集滤 液，置于4°C冰箱保藏。
[0049] II.高效液相色谱法（HPLC)测定iturin A微胶囊剂包埋率
[0050] 流动相：40%乙腈水溶液，加磷酸氢二钾10mM，用磷酸调pH到7。检测波长为 200nm，流速为0. 8ml/min，进样量为20 μ 1。
[0051] 实施例1制备的iturin A微胶囊剂的包埋效果见表1。
[0052] 表1. iturin A微胶囊剂的制备参数及包埋率
[0053]
[0054] 实施例4 :
[0055] iturin A微胶囊剂的抗紫外性能研究
[0056] iturin A微胶囊剂抗紫外线性能以iturin A保留率为衡量指标，iturin A保留 率越高，微胶囊剂抗紫外线性能越好。
[0057]
[0058] 0.20g iturin A微胶囊剂，均匀平铺在玻璃平板上，放置于超净工作台，在距离 30W紫外线30cm处，分别照射6h、12h、18h、24