的应用
【技术领域】
[0001] 本明涉及药物化学技术领域，特别涉及一种去泛素化酶抑制剂 Ni (l-oxidopyridine-2-thione) 2在医学中的新应用。
【背景技术】
[0002] 众所周知，蛋白质是组成细胞的必需物质，是细胞功能活动的主要承担者，调控蛋 白质的更新是细胞代谢的基础环节之一。细胞内约30%的新合成的蛋白质可在10分钟内 被迅速降解（Schubert et al.，2000)。细胞内这种高速的蛋白质更新需要一种特殊的系统 来精准地调控哪些蛋白需要被降解哪些被保留。泛素-蛋白酶体系统就是这样一个调节蛋 白质降解与功能的重要系统。
[0003] 泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-proteasome system, UPS)是近来极受关注 的调控蛋白质降解并参与细胞内多种生命过程的重要系统，UPS由泛素和蛋白酶体组 成，泛素是一个含76个氨基酸的小分子，被泛素标记的的蛋白质会被蛋白酶体识别并 降解；蛋白酶体则是一个负责将蛋白质降解成氨基酸片段的圆筒状大分子。细胞内超 过80%的蛋白质是通过UPS降解的，如降解细胞内错误折叠或受损的蛋白质，细胞周期 调控因子，癌基因，肿瘤抑制因子；调控抗原递呈和转录因子活性等（Coux et al.，1996; Hershko&Ciechanover, 1998) 〇
[0004] 泛素-蛋白酶体系统降解蛋白质主要包括两个步骤：泛素通过一系列泛素启 动酶将靶蛋白标记上多聚泛素链和26S蛋白酶体降解标记上泛素链的靶蛋白。泛素化 过程是动态可逆的，被泛素化的蛋白可以被一种称之为去泛素化酶（DUBs)的特异性 酶所去除。人类基因组编码了约100个DUBs，主要分为2大类：ubiquitin-specific proteases(USPs)，ubiquitin carboxy-terminal hydrolases(UCHs),其中 USPs 占绝大多 数（Fraile et al·, 2012 ;Fortelny et al·, 2014)。去泛素化酶（DUBs)是泛素-蛋白酶 体系统中的重要组成部分，它介导了泛素或泛素链从靶蛋白上移除，是UPS发挥功能的关 键环节。细胞内许多DUBs参与并调节了细胞周期、凋亡和转录等生命过程，与肿瘤的发生 发展密切相关。
[0005] 肿瘤细胞更新代谢快，UPS处于相对活化状态，因此靶向蛋白酶体的抗肿瘤药物 对肿瘤细胞具有选择性从而成为肿瘤治疗的热门靶点。硼替佐米（bortezomib)，商品名 为万河（Velcade)是一种革El向作用于20S蛋白酶体的抑制剂，已经被美国FDA批准用于 临床治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤等疾病，并取得了良好的疗效。由于绝大多数DUBs是半 胱氨酸类蛋白酶，其活性位点的半胱氨酸残基与多种亲电试剂具有很高的反应性，相对于 E3连接酶，以DUBs为靶点更具成药性。相对于20S蛋白酶体抑制剂，大部分DUBs抑制剂 只针对特异的部分去泛素化酶，因此DUBs抑制剂更具选择性。最近几年，相继有文献报 道去泛素化酶抑制剂在抗肿瘤方面展现出显著效果（参见Linder S.等，Nat Med 2011; 17(12):1636-1640 ;Chauhan D,等，Cancer Cell 2012 ;22(3):345 - 358;Liu NN,等， Scientific R印orts 2014 ;4:5240;Liu NN,等，Oncotarget 2014 ;5(14) :5453-5471)综 上所述，去泛素化酶抑制在肿瘤治疗方面具有很好的临床应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种去泛素化酶抑制剂Ni (l_oxidopyridine-2-thione)2在 医学中的新应用。
[0007] 实现上述目的的技术方案如下。
[0008] Ni (l-〇xidopyridine-2-thione)2简称 NiPT，其结构式如下。
[0009]
[0010] Ni (l-〇xidopyridine-2_thione)2在制备防治肿瘤药物中的应用。
[0011] 在其中一个实施例中，所述肿瘤为白血病。
[0012] Ni (l_oxidopyridine-2-thione)2作为去泛素化酶抑制剂在制备防治炎症、组织 缺血-再灌注损伤、心肌肥大疾病的药物中的应用。
[0013] 本发明的另一目的是提供一种防治肿瘤的药物。
[0014] 具体技术方案如下。
[0015] 所述药物的活性成份包括有Ni (l-〇xidopyridine-2_thione)2。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种防治炎症、组织缺血-再灌注损伤、心肌肥大疾病 的药物。
[0017] 具体技术方案如下。
[0018] -种防治炎症、组织缺血-再灌注损伤、心肌肥大疾病的药物，所述药物的活性成 份包括有 Ni (l-〇xidopyridine-2_thione)2〇
[0019] 本发明发现NiPT对去泛素化酶有明显的抑制作用，尤其是26S蛋白酶体相关去泛 素化酶（USP14/UCHL5)。作为金属配合物，NiPT与顺铂等抗癌药物不同，NiPT对DNA分子 没有影响，未引起DNA损伤效应。
[0020] 本发明发现NiPT在癌细胞系中普遍的细胞毒性作用，并对顺铂耐药的细胞系也 有效。而且，NiPT对体内肿瘤有治疗作用，特别是对白血病细胞具有选择性毒性作用。本 发明为临床上防治肿瘤、炎症、组织缺血-再灌注损伤、心肌肥大提供了更多的选择。
【附图说明】
[0021] 图1是NiPT诱导肿瘤细胞内泛素化蛋白量的变化。
[0022] 图2是NiPT对蛋白酶体外源性特异性底物GFPu和泛素化蛋白的影响。
[0023] 图3是NiPT对20S蛋白酶体蛋白酶解活性的影响。
[0024] 图4是NiPT对去泛素化酶尤其是26S蛋白酶体去泛素化酶（USP14/UCHL5)活性 的影响。
[0025] 图5是NiPT与DNA分子相互作用的情况。
[0026] 图6是NiPT在肿瘤细胞中对DNA损伤效应分子的影响。
[0027] 图7是NiPT对多种肿瘤细胞活力的影响。
[0028] 图8是NiPT对非转化细胞（正常细胞）活力的影响。
[0029] 图9是NiPT诱导的细胞凋亡与caspase相关蛋白的表达情况。
[0030] 图10是NiPT抑制蛋白酶体功能和诱导细胞调亡的先后关系。
[0031] 图11是EDTA对NiPT诱导的泛素化蛋白聚集和细胞凋亡的影响。
[0032] 图12是NiPT对白血病细胞蛋白酶体功能和细胞凋亡的影响。
[0033] 图13是NiPT对人外周血单个核细胞蛋白酶体功能和细胞凋亡的影响。
[0034] 图14是NiPT对裸鼠移植瘤（A549)的抑制情况和对肿瘤组织中泛素化蛋白的影 响。
[0035] 图15是NiPT对裸鼠移植瘤（K562)的抑制情况和对肿瘤组织中泛素化蛋白的影 响。
[0036] 图16是合成NiPT的高效液相色谱图和氢谱图。
【具体实施方式】
[0037] 本实施例方式中，发明人发现NiPT对去泛素化酶有明显的抑制作用，尤其是26S 蛋白酶体相关去泛素化酶（USP14/UCHL5)。本发明所述Ni(l-〇xidopyridine-2-thione)2 在制备防治肿瘤药物中的应用。另一个方面，Ni (l-〇xidopyridine-2-thione)2作为去泛素 化酶抑制剂在制备防治炎症、组织缺血-再灌注损伤、心肌肥大疾病的药物中的应用
[0038] NiPT的制备方法，参考文献，具体步骤如下：
[0039] 向配有滴液漏斗及温度计的IOOmL四口烧瓶中，加入6g吡啶硫酮钠和IOmL的去 离子水。调节反应混合物的pH值为8. 5,搅拌加热到70~75°C，在Ih内滴加30%的硫酸镍 水溶液4. 7g，随着硫酸镍的加入，反应混合物的pH值逐渐降低，滴加10%的氢氧化钠调节 到pH为8. 5。保温反应lh，冷却。得到的沉淀用蒸馏水洗涤3次，用25mL乙醇洗涤3次， 在80°C下烘干，得到棕色的Ni(l-〇xidopyridine-2-thione) 2。（参见HOSSEINI SM，KAUFMAN C W，HOBBS P，et al，US，5650095 [P]，1997-07-22)。通过核磁共振氢谱和高效液相色谱方 法鉴定，确认该化合物为Ni(l-〇xidopyridine-2-thione) 2。结果参见图16(a) (b)。
[0040] 为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，以下通过实施例结合图例 对本发明做进一步的阐述，但不用于限制本发明。
[0041] 实施例1 :NiPT诱导肿瘤细胞内泛素化蛋白量的变化。
[0042] 用不同浓度的NiPT(L25,5,7.510yM)分别作用于A549和A459/DDP细胞12 后，收集细胞提取总蛋白，用在K562细胞上的浓度为NiPT(0. 5, 1. 0, 2. 0, 4. 0 μM)，进行 Western Blot免疫印迹，检测Ub-Prs、Κ48-、p