生物粘合剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种生物粘合剂及其制备方法和应 用。
【背景技术】
[0002] 医用粘合剂在医疗器械等领域具有许多用途，包括人体和动物体活性组织创面的 封闭修复、手术创面的封闭止血、活性生理组织间的粘合、活性生理组织与非生理材料间的 粘合等。医用粘合剂按材料性质可分为化学粘合剂和生物粘合剂。化学粘合剂如a_氰基 丙烯酸酯类，虽在临床应用多年，但其降解产物所产生的毒性难以避免。生物粘合剂如纤维 蛋白胶，是一种医用创面封闭剂，是从人或动物血浆中提取的蛋白生物制品，主要应用于手 术创面止血、促进伤口愈合、封闭缺损组织等，已在外科领域得到广泛应用，但来源于异体 的人或动物血清制成的纤维蛋白胶可能激发免疫副反应，其安全性受到广泛关注，同时纤 维蛋白胶粘接强度较低。因此急需开发相容性好、潮湿环境粘接强度高、可生物降解的医用 粘合剂。
[0003] 在海洋环境中，一些成体营固着生活的无脊椎动物，例如贻贝和藤壶，它们能够分 泌蛋白性的粘附剂，牢固地粘附在几乎任何水下物体表面，具有极强的粘结力、湿粘结特性 和耐水性，在生物医用粘合剂、水下胶等领域具有广阔的应用前景。
[0004] 贻贝和藤壶代表了两种典型的水下粘附机制，前者主要是依靠存在于足丝粘附蛋 白中的大量3, 4-二羟基苯丙氨酸(多巴，D0PA)，而后者主要依靠粘蛋白独特的氨基酸组成 和高级结构。贻贝的研究由来已久，足丝粘附蛋白的提取、异源表达以及贻贝仿生粘附材 料的研究取得了较大的进展。目前，美国已有BD Bioscience公司从紫贻贝的足部提取到 粘附蛋白并已进行商业化，名称和货号分别为BD CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE， catalog NO 354240, 35424UBD Cell-Tak用作细胞和组织粘附剂，可以增强细胞或者组织 在各种材料表面(包括塑料、玻璃、金属和各种生物材料)上的粘附。但是贻贝分泌蛋白的量 很少，提取成本高且价格昂贵，很难满足需求。而通过基因工程手段表达重组的粘附蛋白存 在对翻译后修饰的依赖，使得表达功能性的细菌重组贻贝粘着蛋白变得困难；仿生粘附材 料因其结构的简单以及生物相容性等，难以与真正的生物胶媲美。
[0005] 而藤壶较贻贝在水下表面的粘附更为牢固，以致它们的个体死亡后，钙质外壳仍 被紧紧粘附在基材表面，实现牢固的水下粘附。相比于贻贝，藤壶代表了另一种全新的水下 粘附模型。研究表明，藤壶粘着蛋白不存在翻译后修饰现象，因而更易通过生物合成的方式 获得细菌重组蛋白。
[0006] 日本科学家用基因工程的方法表达了红巨藤壶中的胶蛋白cpl9k、cp20k，厦门大 学的研究人员表达了白脊藤壶cp20k蛋白并进行了功能研究，表明cp20k能选择性地粘附 在金属等基体材料表面，而cpl9k在水下粘附中发挥了关键性的作用，能够粘附在水下不 同物理化学特性的材料表面，但目前对白脊藤壶处基因的克隆和表达及其粘附性 能的研究未见报道。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种粘附能力强、产量高、 制备成本低的生物粘合剂，还提供了一种制备方法简单、制备成本低的制备方法；该生物粘 合剂可应用于非生理材料之间、生理材料之间、非生理材料和生理材料之间的粘结。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方法： 本发明的一种生物粘合剂，包括Trx-Balcpl9k融合蛋白，所述Trx-Balcpl9k蛋白的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 上述的生物粘合剂，优选的，还包括溶剂。
[0010] 上述的生物粘合剂，优选的，生物粘合剂的溶剂为醋酸或水。进一步优选的，醋酸 的体积浓度为5%~10%。
[0011] 上述的生物粘合剂，优选的，所述Trx-Balcpl9k蛋白在所述生物粘合剂中的浓度 为 0? 98 ~1. 78 mg/mL。
[0012] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种生物粘合剂的制备方法，所述制备 方法为：Sl、从白脊藤壶软组织提取总RNA，反转录成第一链cDNA; 52、 以步骤Sl中第一链cDNA为模板，根据GenBank数据库中白脊藤壶你处基因 序列设计引物进行PCR扩增得到扩增产物； 53、 将所述步骤S2中得到的扩增产物连接到原核表达载体pET-32a(+)中构建重组质 粒； 54、 将所述步骤S3中构建的重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中得到转化子； 55、 将所述步骤S4中的转化子进行IPTG诱导表达得到表达产物； 56、 将所述表达产物进行镍亲和层析纯化得到Trx-Balcpl9k洗脱液； 57、 将所述Trx-Balcpl9k洗脱液进行透析过夜，得到Trx-Balcpl9k蛋白。
[0013] 上述的制备方法，优选的，还包括以下步骤：将Trx_Balcpl9k蛋白溶于溶剂中得 到生物粘合剂。进一步的，溶剂为醋酸时：将醋酸配制成体积浓度为5%~10%的醋酸溶液， 将Trx-Balcpl9k蛋白溶于所述醋酸溶液中配制成生物粘合剂。进一步的，溶剂为水时：将 Trx-Balcpl9k蛋白溶于水中配制成生物粘合剂。
[0014] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S2中设计的引物为：SEQ ID NO. 3所示的核苷 酸序列、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列。
[0015] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S6中所述亲和层析具体包括以下步骤： S6-1、将表达产物置于层析柱上用咪唑浓度为50~80mM的咪唑缓冲液(咪唑缓冲液的 成分为：50~80mM咪唑、50mM磷酸氢二钠、300mM氯化钠，pH 8. 0)作为漂洗液漂洗层析柱， 以去除非特异结合的杂蛋白； S6-2、用咪唑浓度为250~300mM的咪唑缓冲液(咪唑缓冲液的成分为：250~300mM 咪唑、50mM磷酸氢二钠、300mM氯化钠，pH 8. 0)作为洗脱液洗脱层析柱，获得Trx-Balcpl9k 洗脱液。
[0016] 上述的制备方法，优选的，亲和层析过程中，漂洗液的体积至少为柱床体积的5 倍。
[0017] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S6-1中，作为漂洗液的咪唑缓冲液的流速为 2. 5 ~5ml/min〇
[0018] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S6-2中，作为洗脱液的咪唑缓冲液的流速为 2. 5 ~5ml/min〇
[0019] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S7中所述透析过程中采用的透析液为去离子 水。进一步优选的，去离子水的pH为6~7。
[0020] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法 制备得到的生物粘合剂在生理材料之间粘结中的应用。
[0021] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法 制备得到的生物粘合剂在非生理材料之间粘结中的应用。
[0022] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的生物粘合剂或所述制备方法 制备得到的生物粘合剂在非生理材料与生理材料之间粘结中的应用。
[0023] 与现有技术相比，本发明的优点在于： (1)本发明提供了一种生物粘合剂，该粘合剂主要由Trx-Balcpl9k融合蛋白构成， Trx_Balcpl9k蛋白是由白脊藤壶处基因经克隆、表达后纯化得到。该Trx_Balcpl9k 蛋白粘合剂具有粘附性能强、产量高、制备成本低等优势，适合工业化生产。
[0024] (2)本发明提供了一种生物粘