基于3D-Bioplotter打印技术的骨修复多孔复合支架及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学工程和生物医用材料技术领域，具体涉及一种基于3D-B1plotter打印技术的骨修复多孔复合支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002]骨骼是人体的重要器官，担负着支撑、运动、保护、造血、储存矿物质和代谢等功能。临床上由于外伤、感染、肿瘤和先天性发育不良等造成的大面积骨缺损以及骨质疏松，超过了骨的自我修复能力，需要进行骨修复治疗。传统的骨缺损治疗方法主要包括自体骨移植和异体骨移植，自体骨移植由于来源十分有限，且产生二次手术，给患者带来更多痛苦；异体骨移植又存在着免疫排斥反应和携带病毒及细菌的风险，因此应用受到限制。如何找到更好的骨缺损修复材料已经成为全世界众多科学家共同追求的目标。
[0003]目前，对于骨组织工程材料的研究，主要在无机材料和高分子材料方面，虽然许多研究成果已达到一定的骨修复效果，但总体上还未达到理想骨组织工程支架材料的要求。如无机材料存在降解速度慢、力学性能较差等问题；天然高分子材料则存在不能大规模生产、机械强度不够等问题；人工合成高分子材料的亲水性、机械强度和有机溶剂残留物引起细胞中毒等是该类材料迫切需要解决的问题。PLGA是最早经过美国食品药品局(FDA)认证可用于人体的生物材料之一，其生物相容性好，降解速率可通过调节LA和GA的比例来调控，且降解产物均无毒，可通过体内代谢排除，是骨组织工程中良好的支架材料，但也存在一些缺点，如亲水性较差、机械强度不足，降解后产生的酸性物质会降低聚合物周围的PH值，对细胞生长不利。因此，若能选择一种具有生物活性，可缓解PH值下降，能增强支架机械强度的无机材料与PLGA复合，使两种材料之间互相取长补短，并以合适的工艺方法制备出理想结构的骨组织工程复合支架，具有极其重要的意义。
[0004]组织工程中，不仅要考虑材料的物理化学性质、表面性能等，组织工程支架作为组织再生的框架，其结构特性在组织工程中也起着关键性的作用。一般来讲，理想的骨组织工程支架材料应该具备以下性能:(1)良好的生物相容性，即无明显的细胞毒性、炎症反应和免疫排斥反应，能安全用于人体；(2)合适的可生物降解吸收性，即与细胞、组织生长速率相适应的降解吸收速率；(3)合适的孔尺寸(200-400 μπι)、高的孔隙率(90%以上)和三维多孔结构，以利于大量细胞的增殖、组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长；(4)特定的三维外形以获得所需的组织或器官形状；(5)高的比表面积和合适的表面理化性能以利于细胞粘附、增殖和分化，以及负载生长因子等生物信号分子；(6)良好的可塑形性与植入部位组织的力学性能相匹配的机械强度，以在体内生物力学微环境中保持结构稳定性和完整性，并为植入细胞提高合适的微应力环境；(7 )来源不受限制，易消毒、运输方便。
[0005]骨组织工程的制备方法主要有相分离法、气体发泡法、粒子沥滤法、颗粒烧结法、模板法、静电纺丝技术等。而上述方法一般只能制备孔径小于200 μπι的支架，且有孔隙率小、支架的几何形状不易控制，孔隙之间的连通率不佳等缺点。如相分离法制备的支架孔径偏小；气体发泡法无法精确控制孔隙率、支架形状，且无法做出较大孔径；粒子沥滤法的致孔剂含量又会严重的影响支架的机械强度，且致孔剂的残留会导致细胞毒性；静电纺丝技术制备的支架力学性能较低等。快速成型技术可以根据不同病人的要求和材料的特点，精确控制支架的几何外形、孔径、孔隙率及孔的分布，制定个性化的治疗方案。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于3D_B1plotter打印技术的骨修复多孔复合支架及其制备方法。
[0007]本发明将3D_B1plotter打印技术与微球技术结合起来，制得一种新型复合多孔骨组织工程支架。该支架不仅制备工艺简便快捷，且具有可控的外形和多级孔结构，有利于营养物质与氧的运输，促进细胞的黏附、增殖和分化，可长效诱导骨组织的形成；同时还具有良好的载药释药性能。
[0008]本发明目的通过如下技术方案实现:
一种基于3D-B1plotter打印技术的骨修复多孔复合支架，所述骨修复多孔复合支架由具有三维大孔结构的基体和载药微球复合而成；所述的三维大孔结构基体由3D-B1plotter仪器制备；载药微球由乳化法制备；复合支架由37~65°C低温烧结法制备而成。
[0009]进一步地，本发明中，所述骨修复多孔复合支架的多孔结构由孔径为0.1-1.2mm的大孔、0.05-150 μ m的微米孔和2~50nm的介孔组成，大孔为三维支架基体中的孔洞，微米孔为微球37~65°C低温烧结后形成的微球间孔隙，介孔为六方介孔硅(HMS)中的孔洞。
[0010]进一步地，本发明中，所述骨修复多孔复合支架的孔隙率为60~80%，孔隙连通率为90%以上。
[0011]进一步地，本发明中，所述骨修复多孔复合支架由微球按照特定的排列方式填充在基体中，形成具有特定图案的规则孔结构复合支架，可根据需求制备不同图案的孔结构复合支架。
[0012]进一步地，本发明中，所述骨修复多孔复合支架的基体材料为以下材料中的一种或几种:聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯和聚羟基脂肪酸酯。
[0013]本发明的另一目的通过如下技术方案实现:
一种基于3D-B1plotter打印技术的骨修复多孔复合支架的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备具有规则三维大孔结构的支架基体:
利用计算机辅助设计软件CAD设计出骨缺损部位的三维结构模型，并把该三维模型保存为STL格式文件，然后导入3D-B1plotter中，用B1plotter RP软件对CAD模型的数据进行分层处理，然后将基体材料加入不锈钢料筒中，在VisualMachines软件中设置打印温度、平台温度、针头大小、挤出压力、挤出速度、内部结构和孔径参数，然后启动3D-B1plotter将骨缺损部位的三维结构模型逐层打印成型，形成CAD模型中的规则三维大孔结构的支架基体；
(2)制备载药或生长因子的PLGA/CS/HMS复合微球: 将药物或生长因子与六方介孔硅混合得到药物或生长因子与介孔硅的混合粉体，然后将PLGA (聚乳酸-羟基乙酸共聚物)溶于二氯甲烷中，待12~24h完全溶解后，加入上述混合粉体和硅酸钙粉体(CS)，用高速分散均质机搅拌均匀，得到载药或生长因子的PLGA/CS/HMS共混液；用去离子水配制10~30mg/ml的聚乙烯醇水溶液，然后将上述共混液缓慢滴加到聚乙烯醇水溶液中，搅拌8~20h后将容器底部的复合微球分离出来，真空状态下冷冻干燥24~48 h至完全脱水，制得载药或生长因子的PLGA/CS/HMS复合微球，并用不锈钢筛网分离出目标粒径的复合微球备用；
(3)基体材料与微球的复合:
将载药或生长因子的PLGA/CS/HMS复合微球均匀填充在支架孔道中，置于37~65°C烘箱中，保温2~4h直至微球牢固的粘结在支架孔道中，得到骨修复多孔复合支架。
[0014]进一步地，本发明步骤(I)中，所述的CAD模型为根据人体不同修复部位利用计算机辅助软件设计的特定形状、特定规格、特定尺寸的三维结构模型。
[0015]进一步地，本发明步骤(I)中，所述打印温度为130~160°C，平台温度为20~40°C，针头大小为0.2-0.4_，挤出压力为1.0-3.5bar，挤出速度为1.0-5.0mm/s，孔径为0.1-1.2mm ;内部结构为喷头角度0~179°交错排列，分层厚度为0.16-0.32mm。
[0016]进一步地，本发明步骤(2)中，所述药物或生长因子为以下任意一种或几种:异烟肼、利福平、庆大霉素、BMP-l、BMP-2、BMP-7、BMP-14、TGF-a 和 TGF-β。
[0017]进一步地，本发明步骤⑵中，所述六方介孔娃为实验室自制介孔娃，制备方法如下:将2-5g十二胺、20~60ml无水乙醇、20~60ml去离子水加入250ml的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌；然后加入5~10g正硅酸乙酯搅拌8~12h后陈化30min ;分别用去离子水和乙醇洗涤，放入烘箱干燥后640°C锻烧4h，然后研磨过160目筛网，制得六方介孔硅粉末。
[0018]进一步地，本发明步骤(2)中，所述硅酸钙粉体为实验室自制硅酸钙，制备方法如下:将硅酸钠和硝酸钙按摩尔比为1:1混合搅拌12h，然后陈化30min，用去离子水洗涤4次，真空状态下冷冻干燥24~48h至完全脱水后800°C煅烧2h，然后研磨过160目筛网，制得硅酸钙粉体。
[0019]进一步地，本发明步骤(2)中，所述药物或生长因子浓度为0.2-2mg/ml，六方介孔硅的浓度为10~40mg/ml，硅酸钙粉体的浓度为10~60mg/ml ;聚乙烯醇为1788型、1799型中的一