依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药，特别是一种介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]1.Fe2+供体和Fe 2+依赖性药物(青蒿素类)共转运可显著增强治疗作用青蒿素(artemisinin，ART)是从中药黄花蒿中分离得到的倍半萜内酯化合物，随后又合成了一系列衍生物(双氢青蒿素，青蒿琥酯等)，被广泛用于疟疾的治疗。已有实验证明，青蒿素类药物(为了方便，以下文中以青蒿素(ART)代表)除具有上述治疗作用外，还对肿瘤细胞有很强的杀伤作用。
[0003]肿瘤细胞内的Fe2+能和青蒿素类分子内特有的过氧桥结构(-0-0-)反应，产生以碳原子为核心的自由基或亲电子化合物。此类产物为强烷化剂，通过攻击细胞膜性结构或直接氧化蛋白质分子，以及破坏DNA结构而诱发机体氧化应激反应，导致细胞死亡，为一类Fe2+依赖性抗肿瘤药物。因此，Fe2+是青蒿素类药物发挥其肿瘤细胞杀伤作用的必要条件。
[0004]那么如何使该类药物最大程度的发挥抗肿瘤作用呢？设计Fe2+和该类药物的共转运体系将会有效解决该问题。
[0005]有文献报道使用转铁蛋白(体内唯一能够转运铁离子的内源性蛋白)介导青蒿素类药物传递，从而实现Fe2+和该类药物的共转运，对人肝癌0fepG2)及肺癌(A549)细胞株均有良好的抗肿瘤效果。但是，该递药体系存在Fe2+转运量有限、载药量偏低、机制单一等缺点。
[0006]2.中空介孔四氧化三铁(Hollow 1NPs)的特点
Hollow 1NPs内部具有较大的中空结构，其中空和孔道结构均可荷载药物，具有很高的药物荷载能力。而且具有pH响应型释药功能。在人体中性环境下，Hollow 1NPs能够保持结构的完整性，而在肿瘤部位偏酸性环境下，Hollow 1NPs结构会逐步消蚀，荷载的药物随之释放进入肿瘤细胞，实现肿瘤靶部位定点释药的目的，减少药物的毒副作用。同时由于空心球壳层的保护作用，药物在输送过程中可避免与血浆蛋白或其他生物分子相互作用，因此，可保护药物避免被酶解。
[0007]另外，Hollow 1NPs在交变磁场照射下可以产生热和活性氧。与传统热疗方式(射频、超声、微波等)相比，交变磁场介导的热疗可以在更低的培养温度及更短时间内显著增加细胞膜及血脑屏障的穿透性，为肿瘤治疗提供了一个安全有效的治疗方式。利用Hollow1NPs在交变磁场照射下产生活性氧的性质，可实现磁动力学治疗-化疗协同治疗目的。
[0008]3.透明质酸(HA)修饰纳米载体的优势
HA因其亲水性、良好的生物相容性、生物可降解性、非免疫原性、肿瘤靶向性(受体为CD44)等优势已作为药物载体或靶向分子应用于药物新型给药系统中，并已成为近年来肿瘤治疗研究的热点，被广泛应用于靶向分子成像、靶向药物以及基因治疗等方面。HA修饰的纳米粒不仅可以增加其亲水性和稳定性，延长血液循环时间，还能提高纳米粒的肿瘤靶向性。
[0009]另外，由于肿瘤处与正常组织处的pH差异，使pH响应性药物控释载体在治疗肿瘤方面有着很大优势。利用pH响应性化学键修饰纳米载体，是构建pH响应性载药体系的重要途径。而腙键具有显著的pH敏感性，在偏酸性生理环境下(如肿瘤，pH < 7)会很快水解，而在中性生理环境中则稳定存在(如血液，PH 7.4)。因此利用腙键可实现客体分子在肿瘤部位的定点释放，具有广阔的应用前景，但至今未见有利用Hollow 1NPs对交变磁场的敏感性，可以通过交变磁场远程调控，实现对肿瘤的定位多机制治疗药物的公开报导。
【发明内容】
[0010]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系及其制备方法与应用，可有效解决介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的制备，实现在制备治疗抗肿瘤药物中的应用问题。
[0011]本发明解决的技术方案是，该体系是，透明质酸通过腙键与中空介孔磁性纳米粒(Hollow 1NPs)化学连接，在水介质中形成纳米层，Fe2+依赖性抗肿瘤药物进入中空介孔磁性纳米粒(Hollow 1NPs)的介孔内，构成介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；所述介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系的粒径为20-500nm ;所述和透明质酸为分子量为600 -400000道尔顿。包括以下步骤:
(I)合成中空介孔磁性纳米粒(Hollow 1NPs):室温下，将0.16-0.80g的十二烷基苯磺酸钠加入到15-75ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将0.54-2.5g的氯化铁和0.93-4.5g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在150-200°C下反应8-20小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60°C的真空干燥箱中干燥12-24小时，成中空介孔磁性纳米粒(Hollow 1NPs)；
(2)中空介孔磁性纳米粒(Hollow1NPs)与对羧基苯肼的合成反应:将0.2-0.8g的中空介孔磁性纳米粒溶解在pH 7.4的PBS溶液中，得4mg/ml的中空介孔磁性纳米粒溶液，加入0.40-1.60g巯基乙胺(CYS)，搅拌24h，透析，冻干，得Hollow 1NPs-CYS (巯基乙胺修饰的载体);分别称取Hollow 1NPs-CYS 50-80 mg和HBA (对羧基苯肼)50-80 mg加入到50-100 ml pH 7.4的PBS溶液中，超声溶解，分别加入EDC (1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)80-120 mg和NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)35-60 mg，室温下氮气保护避光反应24-48小时，再用无水乙醇200-300ml沉淀，过滤，用无水乙醇洗涤除去EDC、NHS和多余的HBA，60°C真空干燥24h，得到Hollow 1NPs-HBA，4°C保存；
(3)HA (透明质酸)与Hollow 1NPs-HBA的反应:分别称取50-80 mg Hollow1NPs-HBA和80-100 mg HA加入到50-60 ml DMSO中，超声溶解，室温下避光搅拌24-48h，透析48-72h，每隔8h换液，除去DMSO和多余的HA，冷冻干燥得HA-Hollow 10NPs，4°C保存；
(4)HA-Ho11ow 1NPs 负载 Fe2+依赖性药物的制备:称取 5-20mg HA-HoI low 1NPs 载体，加入到2.5-40ml超纯水中，超声溶解，与乙醇或水溶解的Fe2+依赖性药物混合，经超声或高压均质处理，室温搅拌，采用透析、超滤或柱分离除去有机溶剂及游离药物，冻干，得介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系；
所述的Fe2+依赖性药物是含有过氧基团的倍半萜内酯化合物，优选自青蒿素类药物，包括青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚和二氢青蒿素。
[0012]本发明涉及一种具有介孔门控功能的Fe2+供体与Fe2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系。其方法为通过水热合成法制备多功能中空介孔磁性纳米粒(Hollow 1NPs),以该材料为基体(比表面积大，容量大，密度小，Fe2+供体)，Fe2+依赖性药物(以青蒿素代表:ART)为药物模型，通过腙键连接透明质酸(HA)分子，实现肿瘤靶向性和药物释放的门控作用。该体系在交变磁场照射下产热和活性氧(R0S)，并实现Fe2+供体与Fe 2+依赖性药物共转运、药物定位释放、同一位点多机制治疗肿瘤(热、活性氧和化学药物)，达到远程定位调控肿瘤多机制治疗的目的，经济和社会效益巨大。
【具体实施方式】
[0013]以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0014]实施例1
本发明在具体实施中，介孔门控型的Fe2+供体与Fe 2+依赖性抗肿瘤药物共转运体系由以下步骤实现:
(1)合成中空介孔磁性纳米粒(Hollow1NPs):室温下，将0.3_0.6g的十二烧基苯磺酸钠加入到30-50ml的乙二醇中，搅拌，成澄清透明溶液，然后将l_2g的氯化铁和2_3.5g的乙酸钠加入澄清透明溶液中，搅拌均匀，放入高压反应釜，密封，在160-180°C下反应10-15小时，析出黑色产物，用磁铁吸取黑色产物，弃去液体，黑色产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤至中性，将洗涤后的产物放在60°C的真空干燥箱中干燥15-20小时，成中空介孔磁性纳米粒(Hollow 1NPs)；
(2)中空介孔磁性纳米粒(Hollow1NPs)与对羧基苯肼的合成反应:将0.4-0.