Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及IL-17在提高间充质干细胞免 疫抑制功能中的应用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于 发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化 潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如 间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、 神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可 作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
[0003] 无论在体内实验还是在体外实验中，MSC对于T细胞的免疫抑制机制已经得到了 广泛的研究，目前普遍认为MSC对于T细胞的抑制不是通过诱导T细胞凋亡，而是使得T细 胞的细胞周期停留在G0/G1期。也有研究表明MSC可以促进激活的T细胞的凋亡，但可以 促进静息状态下的T细胞的存活，这也说明MSC发挥免疫抑制依赖于T细胞活化时所释放 的炎症细胞因子的刺激。
[0004] 白介素-17A (interleukin 17A，IL-17A，白细胞介素17,简称为IL-17)是目前已 发现的30余种白细胞介素之一，按序号排在第17位。IL-17由⑶4+T细胞分泌，能够诱导 上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞合成分泌IL-6、IL-8、G-CSF、PGE2,促进ICAM-I的表达。 近年来发现IL-17是一种主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，可以促进T细胞的激 活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬 细胞刺激因子（GM-CSF)和化学增活素及细胞黏附分子I (cellular adhesion molecule 1，CAM-1)，从而导致炎症的产生。IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通 过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。IL-17与受体结合后，可通过MP激酶途径和 核转录因子kB(nuclearfactor kB，NF-kB)途径发挥其生物学作用。Thl7细胞能够分泌产 生11^-17厶、11^-17?、11^-6以及肿瘤坏死因子<1(1：111]1〇1'116(31'〇818€&(31:〇抑，1即-(1)等，这些 细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞。Thl7细胞产生的IL-17能有效地介导中 性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效地介导了组织的炎症反应。
[0005] IL-17作为一种促炎症细胞因子，能够作用于多种细胞类型，进而促进其他一些细 胞因子、趋化因子和金属蛋白酶的表达，包括TNFa、IL-IP、IL-6、GM-CSF、G-CSF、CXCL1、 MMP-3等。同时，IL-17还可以和其他一些细胞因子如TNFa协同促进多种靶基因的表达。 体内的实验研究揭示了 IL-17家族细胞因子在机体抗微生物感染中所发挥的重要作用。尽 管IL-17在机体细菌和真菌感染中起到保护作用，但是IL-17信号通路的过度激活则会导 致自身免疫病的发生。在人自身免疫病中，IL-17是明显上升的，许多研究表明IL-17参与 了诸多自身免疫病的发病进程，包括MS (多发性硬化）、RA (类风湿性关节炎）和IBD (炎症 性肠病）。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂的用途。
[0007] 本发明的另一目的是提供白介素-17拮抗剂的用途。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种经IL-17处理的提高了免疫抑制能力的间充质干 细胞。
[0009] 本发明的第一方面，提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂的用 途，用于制备制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒用于：
[0010] (1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
[0011] ⑵上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
[0012] (3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
[0013] (4)降低RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或
[0014] (5)抑制T细胞的增殖；和/或
[0015] (6)治疗肝炎或肝损伤。
[0016] 在另一优选例中，所述白介素-17是哺乳动物的白介素-17。
[0017] 在另一优选例中，所述白介素-17是人白介素-17。
[0018] 在另一优选例中，所述白介素-17的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0019] 在另一优选例中，所述白介素-17的衍生物包括经修饰的白介素-17分子、氨基酸 序列与天然白介素-17同源且具有天然白介素-17活性的蛋白分子、白介素-17的二聚体 或多聚体、含有白介素-17氨基酸序列的融合蛋白。
[0020] 在另一优选例中，所述经修饰的白介素-17分子是PEG化的白介素-17。
[0021] 在另一优选例中，所述"氨基酸序列与天然白介素-17同源且具有天然白介素-17 活性的蛋白分子"是指其氨基酸序列与SEQ ID NO. :1相比具有彡85%的同源性，较佳地 彡90%的同源性，更佳地多95%的同源性，最佳地多98%同源性；并且具有天然白介素-17 活性的蛋白分子。
[0022] 在另一优选例中，所述"间充质干细胞的免疫抑制功能"是指间充质干细胞对T细 胞的免疫抑制功能。
[0023] 在另一优选例中，所述的制剂或试剂盒中还包含IFN Y和/或TNF a。
[0024] 在另一优选例中，所述激动剂是指能够在体内或体外提高白介素-17或其衍生物 的活性和/或含量的物质。所述物质可以为人工合成的或天然的化合物、蛋白、核苷酸等。
[0025] 在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪 来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
[0026] 在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒 精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
[0027] 在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_双加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0028] 本发明的第二方面，提供了一种白介素-17拮抗剂的的用途，用于制备制剂或试 剂盒，所述制剂或试剂盒用于：
[0029] (1)降低间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
[0030] (2)下调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
[0031] (3)降低MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
[0032] (4)增强RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或
[0033] (5)促进T细胞的增殖。
[0034] 在另一优选例中，所述白介素-17的拮抗剂是指能够降低体内或体外白介素-17 活性的物质。
[0035] 在另一优选例中，所述白介素-17的拮抗剂可以为小miRNA、抗白介素-17抗体或 iNOS抑制剂、Actl蛋白抑制剂、AUFl蛋白激动剂、白介素-17受体的抑制剂、NF K B抑制剂、 TRAF6抑制剂。
[0036] 在另一优选例中，所述的制剂包括药物组合物、保健品组合物、食品组合物、或实 验试剂。
[0037] 在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪 来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
[0038] 在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_双加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0039] 本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物包括白介素-17或其衍生物、 IFN Y 和 TNF a 0
[0040] 在另一优选例中，所述白介素-17或其衍生物、IFNy和TNFa的摩尔比为：1-1〇 : 10 ：10〇
[0041] 在另一优选例中，所述组合物包括固态制剂、液态制剂，较佳地为干粉或溶液形 式。
[0042] 在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
[0043] 本发明的第四方面，提供了一种分离的MSC细胞群，所述MSC细胞群由MSC细胞构 成或基本上由MSC细胞构成，并且所述的MSC细胞具有增强的抑制T细胞增殖的能力，
[0044] 并且，所述的MSC细胞选自下组：
[0045] (1)体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用⑴白介素-17或其衍生 物、（ii)IFNy和（iii)TNFa同时、依次或先后进行处理；
[0046] (2)Actl蛋白过表达和/或AUFl蛋白缺失或活性降低的细胞群；和
[0047] (3)体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用IFN Y和TNF a进行处理；
[0048](4)组（1)、组⑵和组⑶的组合。
[0049] 在另一优选例中，所述预处理中，条件如下：0? 5-1000ng/ml (较佳地l-200ng/ml， 更佳地 l-20ng/ml，最佳地 l-10ng/ml)的 IFN y、0? 5-1000ng/ml (较佳地 l_200ng/ml，更佳 地 l-20ng/ml，最佳地 l-10ng/ml)的 TNF a，和 〇? 2-1000ng/ml (较佳地 0? 5-200ng/ml，更佳 地 l-20ng/ml，最佳地 l-10ng/ml)白介素-17。
[0050] 在另一优选例中，所述预处理中，使用l_2ng/ml IFNy、l-2ng/ml TNFa和 0.5_2ng/ml 白介素-17;或使用 10ng/ml IFNy、10ng/ml TNFa 和 l〇ng/ml 白介素-17。
[0051]在另一优选例中，所述的增强的抑制T细胞增殖的能力指11/10彡1. 5 (较佳地 彡2,更佳地彡4)，其中，Il为所述MSC细胞对T细胞增殖的百分比抑制率；而IO为对照 组的同物种的野生型的MSC细胞对T细胞增殖的百分比抑制率。
[0052] 在另一优选例中，所述的"基本上由…构成"指MSC细胞占所述细胞群中细胞总数 的至少90 %，较佳地至少95 %，更佳地至少99 %。
[0053] 在另一优选例中，所述MSC细胞群具有以下特征：将所述MSC细胞群施用于动物 后，可导致所述动物体内发生选自下组的变化：
[0054] (a)血清ALT的水平下降；
[0055] (b)肝脏中单个核细胞下降；
[0056] (c) CD4+T细胞数下降；和/或
[0057] (d)CD8+T细胞数下降。
[0058] 在另一优选例中，
[0059] (a)血清ALT的水平下降50 %~80 %;
[0060] (b)肝脏中单个核细胞下降50 %~80 %;
[0061] (c)CD4+T细胞数下降50 %~80%;和/或
[0062] (d) CD8+T 细胞数下降 50 % ~75 %。
[0063] 在另一优选例中，所述预处理过程包括步骤：
[0064] 胰酶消化MSC细胞后，先培养至细胞贴壁，然后加入上述浓度的细胞因子，继续培 养6-24小时后，再消化收集细胞群。
[0065] 在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪 来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞等。
[0066] 本发明的第五方面，提供了一种遗传改造的细胞株，所述细胞株是经基因工程改 造从而导致内源的Actl蛋白过表达和/或AUFl蛋白缺失或活性降低。
[0067] 在另一优选例中，所述细胞株为哺乳动物MSC细胞株。
[0068] 在另一优选例中，所述细胞株用于增强间充质干细胞的免疫抑制功能。
[0069] 本发明的第六方面，提供了一种分离的蛋白复合物，所述蛋白复合物为Actl蛋白 和AUFl蛋白结合的蛋白复合物。
[0070] 在另一优选例中，所述蛋白复合物分子量在80KD~130KD。
[0071] 本发明的第七方面，提供了本发明第六方面所述蛋白复合物的应用，所述用途为 用于筛选药物或化合物，所述药物或化合物促进或抑制Actl蛋白和AUFl蛋白形成所述的 复合物。
[0072] 在另一优选例中，所述的药物用于：
[0073] (1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
[0074] (2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
[0075] (3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
[0076] (4)降低RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或
[0077] (5)抑制T细胞的增殖；和/或
[0078] (6)治疗肝炎或肝损伤。
[0079] 在另一优选例中，当应用所述蛋白复合物筛选药物时，所述应用包括步骤：
[0080] (a)将目标物质与MSC细胞共培养；
[0081] (b)检测培养的细胞中所述蛋白复合物的含量。当细胞中所述蛋白复合物含量较 空白对照升高时，则该物质为阳性候选物质。
[0082] 在另一优选例中，所述的筛选中还包括阳性对照组，较佳地所述的阳性对照组中 添加IL17。（实验表明，IL17能增强两个蛋白的结合形成复合物的能力。）
[0083] 在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪 来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
[0084] 在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒 精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
[0085] 在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_双加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0086] 本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有以下组分：
[0087] (a)白介素-17或其衍生物；
[0088] (b)IFNy;和
[0089] (c) TNF a;
[0090]以及使用说明书，
[0091]其中，所述的组分（a)、（b)和（C)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容 器中。
[0092] 在另一优选例中，所述的说明书中描述：所述试剂盒用于
[0093] (1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
[0094] (2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
[0095] (3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
[0096] (4)降低RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或
[0097] (5)抑制T细胞的增殖。
[0098] 在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪 来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
[0099] 在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒 精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
[0100] 在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺_2,3_双加氧酶、PGE2、 TSG6、IL-6、HO-I、IL-10、PD-Ll、Galetin 和 / 或 B7-H4。
[0101] 本发明的第九方面，提供了一种药盒，所述药盒中包括如权利要求3所述的药物 组合物和说明书，所述说明书中记载该药物组合物用于：
[0102] (1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
[0103] (2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
[0104] (3)增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
[0105] (4)降低RNA结合蛋白AUFl的表达水平；和/或
[0106] (5)抑制T细胞的增殖；和/或
[0107] (6)治疗肝炎或肝损伤。
[0108] 在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪 来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
[0109]在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒 精性肝损伤、药物诱导性肝损