一种用于治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能用于治疗骨关节炎和软骨缺损的以黄原胶为媒介的干细胞细 胞治疗组合物，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 骨关节炎（简称0A)是一种伴随有炎症的慢性关节软骨退变性疾病。病理特征为 关节软骨破坏，滑液及滑膜有炎症、关节边缘有骨刺形成和软骨下骨硬化等，可导致严重的 疼痛、功能障碍，严重影响患者生活质量。骨关节炎易发生于膝关节、肩关节、髋关节和手指 关节等部位，是发病率较高的一种疾病，尤其老年人发病率很高。随着全球老龄化，骨关节 炎的发病率和患者人数正逐年增加。骨关节炎的病因及发病机制尚不清楚，车祸、创伤等原 因引起的软骨缺损也会演变为骨关节炎。而且由于关节软骨没有血管和神经，且软骨细胞 自我修复能力弱，受损的软骨很难自己修复等，导致骨关节炎治疗困难，到目前尚无能根本 上治愈骨关节炎的方法。
[0003] 目前，骨关节炎临床治疗方法主要有：早期可用控制重量、有氧运动等非药物治疗 法，非留体类抗炎药物和黏弹性补充剂等药物治疗法；病情较严重者用关节置换等手术治 疗；新型的微骨折、自体或异体软骨或软骨细胞移植术、干细胞治疗等。其中药物治疗仅能 缓解疼痛和病情，并不能根本上治愈骨关节炎，且部分药物副作用较多；关节置换给患者 带来很大的痛苦；自体软骨和软骨细胞来源有限，且软骨细胞扩增能力有限，导致其应用 受到限制。干细胞具有很强的自我更新能力和多项分化潜能，其来源丰富、可从骨髓、脂肪 组织、脐带血、胎盘、滑膜等多种组织分离得到，免疫原性低，因此干细胞治疗是一种具有潜 力的治疗骨关节炎的手段。已有文献报道关节腔注射骨髓来源间充质干细胞、脐带血来源 干细胞和脂肪组织来源干细胞均能缓解骨关节炎的病情（KohYGetal，TheNhee，2012; DavatchiFetal,IntJRheumDis, 2015；VegaAetal,Transplantation, 2015. ) 〇 但 是关节部位炎症环境和磨损的微环境对注入的干细胞的生存很不利，故找到一种合适的媒 介物保护关节腔注射的干细胞，提高干细胞体内生存率很有必要。
[0004] 黄原胶是黄原胶（Xanthan)又称汉生胶，是由野油菜黄单胞杆菌（Xanthomonas campestris)分泌的一种胞外酸性多糖。黄原胶因其优良的物化性质，如分散液的高黏度、 触变性、稳定性等被关注和研究，并在食品工业、医药工业、采油、涂料等诸多方面得到了 广泛的应用。最近研究发现，关节腔注射黄原胶能有效改善骨关节炎的病情，并保护软骨 (ShaoHetal，CarbohydratePolymers，2013;ShaoHRetal，Biorheology，2014.)，但并 不能修复已受损的软骨组织。基于黄原胶缓解骨关节炎的病情和改善骨关节炎微环境的特 性，及干细胞修复受损软骨的特性，本发明提供一种以黄原胶为媒介的关节腔注射治疗骨 关节炎和软骨缺损的干细胞治疗组合物，与生理盐水为媒介的干细胞相比，本组合物干细 胞体内存活率高，改善骨关节炎病情和修复受损软骨组织的效果优于单独的干细胞和单独 的黄原胶。
【发明内容】
[0005] 本发明的目在于提供一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物。
[0006] 本发明的另一目在于提供一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，该组 合物用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损。
[0007] 本发明一种治疗骨关节炎和软骨缺损的细胞治疗组合物，其特征在于该细胞治疗 组合物由干细胞和黄原胶组成，将干细胞混悬于黄原胶溶液或凝胶，其中每2ml黄原胶溶 液或凝胶至少包含2X107个原代至第10代的干细胞。
[0008] 本发明所述的细胞治疗组合物，其中干细胞是指由患有骨关节炎和软骨缺损的患 者或细胞捐赠者的包括脂肪组织、骨髓和脐带等组织中分离的原代至第10代的多能性间 充质干细胞。
[0009] 本发明所述的细胞治疗组合物，优选由患有骨关节炎和软骨缺损的患者或捐赠者 的脂肪组织或骨髓中分离的原代至第10代的多能性间充质干细胞。
[0010] 获取脂肪组织来源干细胞的方法如下：取患者自体或脂肪捐赠者腹部、臀部或膝 盖脂肪垫等脂肪组织，用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7. 4,以下均同）洗3次（如果是脂肪块先 剪碎），加同体积〇. 15 %I型胶原酶，于37°C，200r/min条件下震荡消化lh，消化液加PBS稀 释一倍，1800r/min离心lOmin得到沉淀，沉淀加红细胞裂解液于37°C条件下放置5min，除 去红细胞，1200r/min离心5min得到沉淀。沉淀再用PBS洗1次，用含10%胎牛血清（FBS) 的L-DMEM培养基（或人间充质干细胞无血清培养基）混悬，用200目细胞筛过滤，5X104细 胞/cm2接种于10cm细胞培养皿中，于37°C，5%C02和饱和蒸汽压标准条件进行培养，培养 24h后大部分干细胞贴壁，弃去未贴壁的细胞，加入新的培养基继续培养。前两天每天换一 次新的培养基，往后每隔两天换一次新的培养基，待细胞长满80%底面积时1:2进行传代。 [0011] 获取骨髓来源干细胞的方法如下：取患者自体或捐赠者的骨髓，1200r/min离心 lOmin，沉淀加红细胞裂解液，裂解红细胞，1200r/min离心5min。细胞用10 %FBS的L-DMEM培养基（或人间充质干细胞无血清培养基）混悬接种到培养皿中并在37°C、5%C02和饱 和蒸汽压标准条件进行培养。过24h大部分干细胞已贴壁，将未贴壁的细胞弃去，加入新的 培养基继续培养。培养前两天每天换一次培养基，后期每隔一天换一次培养基，待细胞长满 80%底面积时1:2进行传代。
[0012] 本发明所述的细胞治疗组合物，其制备方法是将原代至第10代的单层培养的干 细胞用PBS洗3次，再用0. 25 %的胰蛋白酶-0. 02 %EDTA消化液消化3min，加适量的含 10%FBS的L-DMEM培养基（或人间充质干细胞无血清培养基），轻轻吹打细胞使其脱落，混 悬为单细胞混悬液，计数，1200r/min离心3min，弃上清，再用PBS洗2次，按至少1X107细 胞/ml的量加入适量的已灭菌的黄原胶溶液或凝胶慢慢搅拌，细胞均匀后即得。
[0013] 本发明所述的细胞质治疗组合物，其中2mL黄原胶溶液或凝胶至少包含2X107个 原代至第10代的干细胞。
[0014] 本发明所述的黄原胶溶液或凝胶是将黄原胶溶于生理盐水或PBS，并经加热灭菌， 制成浓度为10~30000yg/ml，优选100~10000yg/ml黄原胶溶液。
[0015] 本发明所述的黄原胶，其平均相对分子量为200万~2000万，优选1000万~2000 万。
[0016] 本发明所述的细胞治疗组合物用于关节腔注射治疗骨关节炎和软骨缺损。
[0017] 本发明的有益之处在于，细胞治疗组合物中的干细胞在关节腔内存活率高，治疗 骨关节炎的效果明显优于生理盐水混悬的干细胞和单独的黄原胶。黄原胶作为干细胞媒 介，解决了关节腔注射的干细胞关节腔内存活率低的问题。
【附图说明】
[0018] 图1原代脂肪组织来源干细胞（100X)
[0019] 图2第1代脂肪组织来源干细胞（100X)
[0020] 图3第10代脂肪组织来源干细胞（100X)
[0021 ] 图4黄原胶对脂肪组织来源干细胞增殖的影响
[0022] 图5关节股骨软骨表面大体观察评分结果
[0023] 图6关节胫骨软骨表面大体观察评分结果
[0024] 图7关节软骨组织Mankin评分结果
[0025] 图8软骨缺损修复组织学评分结果
【具体实施方式】
[0026] 实施例1提取和培养脂肪组织来源干细胞
[0027] 本实施例用于说明脂肪组织来源干细胞提取和培养方法，具体步骤如下。
[0028] 取患者自体或脂肪捐赠者腹部脂肪组织，用PBS洗3次，用同体积的0. 15%I型胶 原酶消化lh，消化液加PBS稀释一倍1800r/min离心lOmin，得到沉淀；沉淀用PBS混悬，加 红细胞裂解液，除去红细胞，1200r/min离心5min得到沉淀；沉淀再用PBS洗一遍，用10 % FBS的L-DMEM培养基（或人间充质干细胞无血清培养基）悬接种到培养皿中并在37°C、 5%C02和饱和蒸汽压标准条件进行培养；过24h大部分干细胞已贴壁，将未贴壁的细胞弃 去，加入新的培养基继续培养；培养前两天每天换一次培养基，后期每隔一天换一次培养 基；待细胞汇至80%进行传代培养。
[0029] 传代培养方法如下：单层培养的干细胞用PBS洗3次，再用0.25%胰蛋白 酶-0. 02%EDTA消化液消化3min，加适量的含10%FBS的L-DMEM培养基（或人间充质干 细胞无血清培养基），轻轻吹打细胞使其脱落混悬为单细胞混悬液，按1:2比例进行传代培 养。原代细胞、第1代细胞和第10代细胞形状见图1~3。
[0030] 实施例2分离和培养骨髓来源干细胞干细胞
[0031] 本实施例用于说明骨髓来源干细胞提取和培养方法，具体步骤如下。
[0032] 采集患者自体或骨髓捐赠者骨髓，1200r/mi