一种五子衍宗方总多糖的提取方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种五子衍宗方总多糖的提取方法及其在保护肝损伤上的应用，属于 生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 五子衍宗方作为我国传统中草药配方，由车前子、覆盆子、五味子、构杞子、寃丝子 五味药组成，性平味甘的构杞子和性平味甘的寃丝子作君药，补肝肾之阳，五味子和覆盆子 作为臣药，性溫，味甘而酸，五味子有生血之功，覆盆子能滋精，两药均为溫性，不热不燥，起 溫和泌精滋肾之用，车前子是该药方中唯一的味甘性微寒之成分，作为佐药，起利尿固精之 效，同时可泻肾中虚火，W其微寒之性对药方中其他药物的溫性略起制约作用。
[0003] 五子衍宗方补肾益精，填精补髓，疏利肾气，种耐衍宗，被历代医家所推崇，因对男 性不育症有较好的疗效，被誉为"古今种子第一方。多用于治疗男性泌尿生殖系统疾病，同 时也用于治疗妇科疾病和脂肪肝等疾病，对神经系统、免疫系统也有作用。具有延缓衰老、 增强免疫等多种药理作用。 阳004]环憐酷胺（cyclo地OS地amide,CTX)是一种临床常用的抗肿瘤药物，广泛用于治 疗各种实体瘤和血液系统疾病，该药作为最常用的烧化剂抗肿瘤药，进入体内后，在肝微粒 体酶催化下分解产生烧化作用很强的产物，能对肿瘤细胞产生细胞毒作用，抑制细胞增殖、 诱导肿瘤细胞调亡。但是其在抑制肿瘤细胞的同时，也会影响人体正常细胞的增殖、分化， 从而导致多种副作用，除骨髓抑制、屯、脏毒性、生殖系统毒性等，还有肝脏毒性，可导致肝损 伤，引起肝细胞巧死，此外本品还具有显著的免疫抑制作用。 阳0化]现代药理研究显示，五子衍宗方能改善生殖功能、增强免疫功能、抗氧自由基损 伤，可用于治疗男性泌尿生殖系统疾病、妇科疾病、脂肪肝等疾病，具有延缓衰老、增强免疫 等多种药理作用。且随着AD发病率的升高和治疗药物的匿乏，五子衍宗方对MCI的有效干 预使其具有作为AD治疗候选药物的发展前景。五子衍宗丸的药理作用是相当广泛的，但对 神经系统、免疫系统、糖代谢等作用还需进一步完善，对抗炎抑菌、循环系统及抗肿瘤方面 的药理作用未见相关报道，对此尚待研究。
【发明内容】
[0006] 在上述文献报道的基础上，本发明通过化疗药物CTX造模，与此同时，用不同剂量 的五子衍宗方总多糖作为治疗药物，处理动物后检测其肝组织形态学变化，血清常规检查， 肝脏SOD活力和MDA含量，验证五子衍宗方总多糖对CTX所致的肝损伤有保护作用。
[0007] 本发明包括了中药配方五子衍宗方中总多糖提取的优化工艺，及其总多糖对环憐 酷胺所致小鼠肝损伤的保护作用。 阳00引药品与试剂
[0009]五子衍宗方由40g寃丝子、40g构杞子、5g五味子、20g覆盆子、lOg车前子组成， 均由宜昌本草堂大药房提供；CTX购自江苏恒瑞医药股份有限公司；丙氨酸氨基转移酶 (Alaninetransaminase，ALT)、天冬氨酉辩专氨酉每（Aspartatetransaminase，AST)、超氧化 物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD)、丙二醒（Malondialdehyde，MDA)试剂盒购自南京 建成生物工程公司。仪器
[0010] ZNHW型智能恒溫电热套由巩义市予华仪器有限责任公司生产；循环水多用真空 累由西安泰康生物科技有限公司生产；低溫冷却液循环累由郑州长城科工贸有限公司生 产；EYELA油浴锅由上海爱朗仪器有限公司制造；包埋机；离屯、机；酶标仪；万分之一天平。
[0011] 实验动物
[0012]SPF级Ba化/C雄性小鼠，8周龄，湖北省实验动物中屯、提供。分笼饲养，环境溫度 (20±2)°C，相对湿度55%~65%，1化光照，晒齿类动物饲料喂养，自由饮水。五子衍宗方 总多糖的提取方法
[0013] 1.称取干燥粉碎的构杞子，寃丝子，五味子，覆盆子，车前子，加入75%乙醇，浸泡 过夜，用双层滤布过滤，将过滤后的滤渣置于60°C烘箱中挥干乙醇；干燥后，加蒸馈水，沸 水浴回流提取1.化，双层滤布过滤，滤渣重复提取一次，过滤后合并两次滤液，于80°C水浴 浓缩，将浓缩液在氯仿与正下醇W体积比4:1的混合液中反复脱蛋白，萃取后水层离屯、，上 清液水浴浓缩后加入95 %乙醇，终体积分数为75 %，再放入4°C冰箱中醇沉过夜，然后W 480化/min离屯、lOmin，滤渣依次用无水乙醇、丙酬、乙酸各洗两次，通风楓干燥，得褐色粉 末，即五子衍宗方总多糖提取物。
[0014] 动物分组
[0015] 取健康雄性ba化/c小鼠36只，随机分为4组：正常对照组、模型对照组、五子衍宗 方总多糖低剂量组、总多糖高剂量组，每组9只。
[0016] 肝组织损伤造模及动物处理
[0017] 总多糖低、高剂量组提前3天给药，第3天开始，除正常对照组注射等量生理盐水 夕F，其余各组均腹腔注射CTX50mg/kg造模，每隔2天给1次，共10次，给药组继续给药。最 后一次注射CTX后，禁食不禁水，12小时后处死小鼠。肝组织形态学观察
[0018] 每只小鼠取同一部位肝组织，甲醒固定，石蜡包埋，切片，肥染色后用显微镜观察 其肝组织形态学变化。
[0019] 肝脏指数
[0020] 末次给药12h后称小鼠重量，小鼠处死后取出肝脏称重，用肝脏重量除W小鼠体 重，计算得到肝脏指数。
[0021] 血清生物化学指标检测
[0022] 各组小鼠眼眶采血，静置30min，离屯、后取上清，按照AST、ALT试剂盒进行操作，检 测血清AST和ALT活性。
[0023] 抗氧化指标检测
[0024] 取各组小鼠肝组织，冰浴条件下用生理盐水洗净，再加4°C生理盐水匀浆制10 % 肝组织匀浆液，4°C条件下用3500r/min离屯、，离屯、后取上层清液，每次离屯、lOmin，直至离 屯、后下层无沉淀。按照SOD和MDA试剂盒说明进行操作，检测肝组织SOD活力和MDA含量。 统计学处理
[0025]数据W平均值+标准偏差（X+巧表示，组间差异采用t-检验，P<0. 05表示差异 有统计学意义。
[00%] 采用本发明的技术方案得到的五子衍宗丸总多糖可显著减轻CTX所致的肝细胞 的损伤程度。其机制可能与提高了体内抗氧化酶的活性和自由基清除剂水平，保护机体免 受氧自由基的攻击有关。五子衍宗方总多糖对肝损伤有保护作用。
【附图说明】
[0027] 图1为五子衍宗方总多糖对小鼠肝脏指数的影响，注：冲<0. 05 ;*冲<0. 01 (与正常 对照组比较）；胖<0. 05, #胖<0. 01 (与模型对照组比较）。
[0028] 图2为各组小鼠肝脏组织形态学观察，其中，A为正常对照组，B为模型对照组，C 为总多糖低剂量组，D为总多糖高剂量组。
【具体实施方式】 阳〇29] 实施例1
[0030] 称取干燥的构杞子160g，寃丝子160g，五味子20g，覆盆子80g，车前子40g，装入 大烧瓶，加入75%乙醇化，浸泡过夜，用双层滤布过滤，除去五子衍宗方中溶于醇的物质， 将过滤后的滤渣置于60°C烘箱中挥干乙醇。干燥后，加2.化蒸馈水，沸水浴回流提取1.化， 双层滤布过滤，滤渣重复提取一次，过滤后合并两次滤液，于80°C水浴浓缩至约1500mL， Sevag法（氯仿