聚环氧烷戊酸酯血红蛋白缀合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明总体上设及聚环氧烧（PAO)血红蛋白缀合物。更具体地说，本发明设及具 有改善的稳定性的PAO血红蛋白缀合物、包含此类缀合物的药物组合物W及合成和使用该 缀合物的方法。
[000引发明背景
[0003] 早已将血红蛋白类氧载体（"皿OC")与归因于血红素清除一氧化氮（NO)的血管 收缩联系起来。用作氧治疗剂（有时称为"携氧血浆扩容剂"）的氧载体例如稳定血红蛋白 化b)已经被证实功效有限，运是因为它们清除了一氧化氮，引起血管收缩和高血压。在动物 和人类中，运些携氧溶液引起血管收缩的倾向可W表现为高血压。虽然皿OC的血管收缩效 应的根本机制不是很清楚，但是已经表明血红素铁可W迅速且不可逆地与内源性NO(-种 强效的血管扩张剂）结合，从而引起血管收缩。
[0004] 部分由于运些血管收缩效应，虽然包含修饰型无细胞化的产品已经是最有前景 的，但是至今尚无氧载体完全成功地用作氧治疗剂（OTA)。美国军方已经开发了a链与 双-二漠水杨基-富马酸醋之间交联的人化（aa化）作为模型红细胞替代品，但是其在表 现出肺部和全身血管阻力严重增加后被放弃化ess,J.等人，1991，Blood78:356A)。运种 产品的商业形式在令人失望的III期临床试验后也被放弃（Winslow,R.M.，2000,VoxSang 79:1-20)O
[0005] 已经提出了两种分子方法来尝试克服化的NO结合活性。第一种方法使用远端 血红素口袋的定点诱变W试图产生NO结合亲和力降低的重组血红蛋白巧ich，R.F.等 人，1996,Biochem. 35:6976 - 83)。第二种方法使用化学修饰法，其中通过寡聚化增大化的 尺寸，W试图降低或可能完全抑制化从血管间隙外渗到胞间隙化ess,J.R.等人，1978,J. Appl.Physiol. 74:1769_78;Muldoon,S.M.等人，1996,J.Lab.Clin.Med. 128:579-83; Macdonald,V.W.等人，1994,Biotechnology22:565-75 !F^irchgott,R., 1984,Ann. Rev.Pharmacol. 24:175-97;W及Ki化ou;rne,R.等人，1994,Biochem.Biophys.Res. Commun. 199:155-62)〇
[0006] 事实上，已经生成了在最大负载大鼠实验中血压不那么高且对NO的缔合结合速 率降低的重组化值〇herty，D.H.等人，1998,化UireBiotechnology16:672-676W及 Lemon,化化等人，1996,Biotech24:378)。然而，研究表明NO结合可能不是化血管活性的 唯一解释。已经发现，某些大化分子例如被聚乙二醇（阳G)修饰的那些大化分子实际上 没有血管收缩，即使其NO缔合速率与严重高血压aa化相等（Rohlfs，R.J.等人，1998,J Biol.化em. 273:12128-12134)。此外，发现当阳G-冊在出血之前作为交换输血提供时，其 对预防出血后果非常有效（Winslow,R.M.等人，1998,J.Appl.Physiol. 85:993-1003)。
[0007] 阳G与化的缀合降低了其抗原性并且延长了其循环半衰期。然而，已经报道了 阳G缀合反应导致化四聚体解离成a0 -二聚体亚基，导致在接受化单体单元的阳G缀 合物的交换输血大鼠体内产生低于40, 000道尔顿广化"）的总血色蛋白尿（Iwashitaand AjisakaOrgan-DirectedToxicity:Chem.IndiciesMech. ,Proc.Symp. ,Brown等人 1981 年编辑，F*ergamon,Oxford, !England，第 97-101 页）。由Elnzon,Inc.制备 了分子量大于 84, 000道尔顿的聚环氧烧广PA0")缀合化（美国专利号5, 650, 388)，其携带了约10个拷 贝的PEG-5, 000链，链接至化的a和E-氨基。运种取代度被描述为避免了哺乳动物中 与血红蛋白尿相关的临床显著肾毒性。然而，缀合反应产生了异质缀合物群体并且含有必 须通过柱色谱法去除的其它非期望的反应物。
[0008]PEG缀合通常通过活化PEG部分与生物分子表面上的官能团的反应来进行。最常 见的官能团为赖氨酸的氨基、组氨酸残基的咪挫基和蛋白质的N末端；半脫氨酸残基的硫 醇基；W及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的径基和蛋白质的C末端。PEG通常通过将径基末 端转化为能够在溫和水性环境中与运些官能团反应的反应性部分而活化。用于缀合治疗 性生物药品的最常见的单官能阳G之一是甲氧基-PEG( "mPEG-OH")，其只有一个官能团 (即径基），从而将与双官能PEG相关的交联和聚集问题减到最少。然而，由于其生产工艺， mPEG-OH经常受范围可W高达10-15%的高分子量双官能阳G(即"PEG二醇"）污染值USt J.M.等人，1990,Macromolecule23:3742-3746)。运种双官能PEG二醇具有约为所需单官 能阳G两倍的尺寸。随着阳G分子量的增加，污染问题进一步加重。mPEG-OH的纯度对PEG 化生物治疗剂的生产尤为重要，因为FDA在最终药物产品的生产工艺和质量方面要求有高 水平的再现性。
[0009] 已经在氧合和脱氧状态下进行了化与PAO的缀合。美国专利号6, 844, 317描述 了通过在缀合之前使化与大气平衡缀合呈氧合或"R"状态的化，W增强所生成的PEG-冊 缀合物的氧亲和力。其他人描述了在缀合之前用来减小氧亲和力并增加结构稳定性的脱氧 步骤，运使得化能够经受化学修饰、渗滤和/或无菌过滤和己氏杀菌的物理应力（美国专 利号5, 234, 903)。对于化的分子内交联，提出为了使a-链的赖氨酸99暴露于交联剂，可 能需要在修饰前使化脱氧（美国专利号5, 234, 903)。
[0010]Acharya等人研究了在与PEG缀合前用2-亚氨基硫杂环戊烧使化硫醇化的动力 学（美国专利号7, 501，499)。观察到，使亚氨基硫杂环戊烧的浓度从每个四聚体平均引入5 个外来硫醇的10倍增加到30倍几乎使化上的外来硫醇数量翻倍。然而，即使具有双倍数 量的硫醇，PEG缀合后所见的尺寸增加也只有少量。运表明在20倍摩尔过量的马来酷亚胺 基PEG-5000存在下的缀合反应用较少的反应性硫醇覆盖化表面，导致抵抗用更多反应性 硫醇进一步修饰化的立体干扰。因此，为了实现修饰型化的所需缀合度（即6± 1个PEG/ 化分子），Acharya等人用8-15倍摩尔过量的亚氨基硫杂环戊烧使化硫醇化，然后使硫醇 化化与16-30倍摩尔过量的马来酷亚胺基阳G-5000反应。然而，在大规模生产中，运些高 摩尔过量的反应物浓度明显增加了制备皿OC的成本并且增加了最终产物的异质性。而且， 运种高摩尔过量的马来酷亚胺基PEG-5000还随着更多数量的非所要副反应物的生成产生 更异质的产品。
[0011] 在先前研究中，观察到表面被修饰的血红蛋白的分子大小必须足够大W免被肾脏 清除并实现所需的循环半衰期。Blumenstein,J.等人确定，运可W在84, 000道尔顿广化"） 的分子量或高于该分子量下实现广BloodSubstitutesandPlasmaExpanders,"Alan R-Liss编辑，New化rk，N.Y.，第205-212页（1978))。在该研究中，作者使不同分子量的葡 聚糖与化缀合。他们报道称，化（分子量为64,OOODa)和葡聚糖（分子量为20,OOODa)的 缀合物"被从循环中缓慢清除并且可W忽略通过肾脏的清除"。另外，观察到增加分子量到 高于84,OOO化并未明显改变运些清除曲线。分子内交联将四聚体血红蛋白单元的亚基化 学结合在一起W防止形成被肾脏过早排泄的二聚体（参见例如美国专利号5, 296, 465)。
[0012] 为了使聚环氧烧与血红蛋白结合，必须首先使聚合物的末端基团"活化"（即，转化 成反应性官能团）W形成"活化聚环氧烧"。过去，使用PEG-OH来制备PEG-面化物、甲横酸 醋或甲苯横酸醋，然后通过进行与氨水（霍夫曼反应化OffmannReaction))、叠氮化钢或 邻苯二甲酯亚胺钟（加布里试剂（G油rielReagent))的亲核置换反应将其转化为PEG-胺。 阳G-面化物与氨的反应直接形成阳G-胺（叩EG-NHz")(参见Zalipsky等人，Eur.Polym. J. 1983, 19:1177-1183)，其然后可用于与在一些生物活性化合物上发现的-COOH基团缀 合。
[001引最近，PEG-NHz已经被用作中间物且可W进一步被官能化W与除-COOH外的基团结 合。例如，可W将PEG-NHz修饰为琉基活化基团例如马来酷亚胺。在美国专利号6, 828, 401 公开的反应中，通过使mPEG-OH与对甲苯横酷氯（甲苯横酸化剂）和S乙締胺（"TEA",碱 催化剂）在二氯甲烧（有机溶剂）中反应生成m阳G-甲苯横酸醋来制备m阳G-马来酷亚胺 (即，已经加上马来酷亚胺的甲氧基-PEG或mPEG)。然后使该化合物与28%氨水反应，接着 与马来酸酢在N，N-二甲基乙酷胺广DMAC")和N-环己基化咯烧酬广CHP")的有机溶剂混 合物中反应，W生成马来酷胺酸化合物。然后使该化合物与=氣乙酸五氣苯醋在碱催化剂 例如二乙基苯胺（"DEA")或二异丙基乙胺（"DIEA")的存在下，在二氯甲烧和二甲基甲 酷胺（"DMF")的有机溶剂混合物中反应，W生成m阳G-马来酷亚胺。然而，运种用于获得 活化PEG的多步骤多试剂方法繁琐且耗时。
[0014] 本文公开了用于制备PEG-血红蛋白缀合物的方法，该方法是使用在特定条件下 结合至血红蛋白的胺基的班巧酷亚胺基戊酸醋活化阳G(SVA-阳G)形成稳定均质的阳G-血 红蛋白缀合物。 发明概要
[0015] 本发明的一个方面设及PAO血红蛋白缀合物，其具有在37°C和抑7. 4下测量的介 于约2至约30mmHg的P50。PAO经由血红蛋白分子上的氨基酸侧链的氨基反应性部分共价 连接。氨基反应性部分通过-C(O) - (CHz)P-链接至PA0,其中P是1至约20的整数。血 红蛋白任选地分子内交联。
[0016] 本发明的另一个方面设及具有W下结构的PAO血红蛋白缀合物
[001引其中化是血红蛋白，L是链接子-C(O) - (CHz)P-，N是血红蛋白的氨基，X是端 基，m是缀合至血红蛋白的活化PEG聚合物的平均数目，n是平均分子量为约2, 000至约 20, 000道尔顿的阳G的氧亚乙基单元的平均数目，且P是1至20的整数。
[0019] 本发明的又一个方面设及通过包括使血红蛋白与至少一种PAO聚合物反应的方 法而制备的PAO血红蛋白缀合物。PAO聚合物具有W下结构：
[0021] 其中R是氨基反应性部分，L是链接子-C(O) - (CHz)P-,X是端基，n是平均分子 量为约2,000至约20,000道尔顿的阳G的氧亚乙基单元的平均数目，且P是1至20的整 数。
[0022] 本发明的再一个方面设及药物组合物，其包含任何上述血红蛋白缀合物和药学上 可接受的载体。该组