癌细胞陷阱的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 此申请要求2012年10月20日提交的美国临时申请61/716, 526的优先权，该临 时申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。
[0003] 联邦政府资助研究和开发的声明
[0004] 此发明得到政府支持，在美国国立卫生研究院给予的拨款No.R01，EB007271-01 下作出的。政府拥有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明的领域大体来说涉及癌症领域。本发明的领域还涉及癌细胞陷阱以及其用 于治疗和/或防止癌症转移以及用于诊断和检测癌症转移的用途。
【背景技术】
[0006] 转移或转移性疾病是指疾病从一个器官或部分扩散到另一非邻近器官或部分。 转移性疾病主要与恶性肿瘤细胞和感染相关，但不是唯一相关（Klein，2008, Science 321 (5897) : 1785-88 ;Chiang&Massague, 2008, New Engl. J. Med. 359 (26) : 2814-23)。转移性 肿瘤在癌症的后期非常常见。例如，黑素瘤的高致死率是由于黑素瘤细胞能够转移到身体 的几乎任何部分的能力引起的。应当指出的是，癌症转移到不同的器官是许多癌症的常见 并发症，并造成90%的人癌症死亡。目前，第III和IV期转移性黑素瘤的患者通常通过手 术切除、放疗、化疗、生物化疗或者它们的组合来治疗。可惜的是，这些治疗通常具有长远的 全身性副作用，且不会大幅改善预后。
[0007] 最常见的发生转移的地方是肺、肝、脑和骨。某些肿瘤还有种植于特定器官的倾 向。例如，前列腺癌通常转移到骨。类似地，结肠癌具有转移到肝的倾向。胃癌通常转移至 女性的卵巢。乳腺肿瘤细胞往往却会转移到骨组织。研究表明，这些组织选择性转移过程 是由特定解剖和机械途径造成的。
[0008] 癌症转移可以分为一系列的步骤和路径，包括通过细胞外基质侵入、侵入到 淋巴或血管、在循环中存活、渗出到远端部位，以及在该部位逐渐增长。参见例如， Chambers, A. F. , A. C. Groom, and LC. MacDonald, Nat Rev Cancer, 2002. 2 (8) :p. 563-72 ； Fidler,I.J. , Nat Rev Cancer, 2003. 3(6) :p. 453-8 ；and Folkman, J. , Semin Cancer Biol, 1992. 3(2) :p. 65-71。
[0009] 尽管进行了大量的研究工作，但是还未完全了解癌症转移的详细机制。造成这种 不足至少部分是因为缺乏可用来以可控的方式定量癌症转移的程度的动物模型。数种体外 和体内模型在过去已经用以评估癌症转移。转移的大多数研究已在具有异种移植瘤的啮齿 动物上进行。参见例如Welch DR. Clin Exp Metastasis 1997;15:272-306 ;Gupta GP, Perk J, Acharyya S, de Candia P, Mittal V, Todorova-Manova K, et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2007 ;104:19506-19511 ;以及Yamamoto M, Kikuchi H, Ohta M, Kawabata T, Hiramatsu Y, Kondo K,et al. Cancer Res2008;68:9754_9762。
[0010] 在自发转移的试验中，将肿瘤细胞注射到部位中，优选原位位置。原发肿瘤形成， 并且发生转移，接着随时间进行监控该转移。尽管此试验测量了完整的转移过程，但这种 方法通常是定性的并且耗时的参见例如Cespedes MV，Casanova I，Parreno M，Mangues R. Clin Transl Oncol 2006;8:318-329;和Talmadge JE，Singh RK，Fidler IJ，Raz A.Am J Pathol2007;170:793-804。 toon] 转移评估还这样进行：将肿瘤细胞注射到血流中，然后对重要器官中的肿瘤生长 进行定量测量。这种方法仅可提供关于转移的血管内渗后期（post-intravasation)阶段 的信息。还应注意到，几种转基因小鼠品种已被用于研究原发性肿瘤形成和自发转移。参见 例如 Talmadge JE，Singh RK，Fidler IJ，Raz A.Am J Pathol 2007 ;170:793_804;Khanna C，Hunter K.Carcinogenesis 2005 ;26:513-523 ;Schwertfeger KLj Xian Wj Kaplan AM，Burnett SH，Cohen DA，Rosen JM. Cancer Res 2006;66:5676-5685;以及 Taketo MM，Edelmann W. Gastroenterology2009 ; 136:780-798。然而，这些系统的显著缺点是昂贵、 不可预测性以及缺乏通用性。
[0012] 许多报告涉及炎症信号辅助转移性细胞从原肿瘤逃逸并扩散到新的部位。参见 例如Lorusso，G. and C.Ruegg，Histochem Cell Biol，2008. 130(6) :ρ· 1091-103 ;Lu，H.，W. Ouyang，and C. Huang，Mol Cancer Res，2006. 4(4) :ρ· 221-33 ;Marx，J.，Science，2004. 306 (5698):p. 966-8;以及 Pollard，J. W.，Nat Rev Cancer，2004.4(l):p.71-8〇
[0013] 此外，越来越多的证据表明，炎症反应在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。参 见例如 Lorusso，G. and C.Ruegg，Histochem Cell Biol，2008. 130(6) :ρ· 1091-103; Lu, Η. , ff. 0uyang? and C-HuangjMol Cancer Res, 2006. 4 (4) :p. 221-33 ；Aggarwal, B. B.，et al，Biochem Pharmacol，2006. 72 (11) :p. 1605-21 ;Arias，J. I.，M. A. Aller，and J. Arias，Mol Cancer，2007. 6:p. 29 ;以及 Melnikova，V. 0· and M. Bar-Eli，Pigment Cell Melanoma Res，2009. 22(3) :p. 257_67〇
[0014] 例如，炎症趋化因子如 CXCL12(SDF-1)/CXCR4、CCR7/CCL21、MIP-la/CCL3、 IL-8/CXCL8和RANTES/CCL5，与乳腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、结直肠癌、卵巢癌和肺癌相 关。Ben-Baruch，A.，Cancer Metastasis Rev，2006. 25 (3) :ρ· 357-71 ;Gomperts，B. N. and R. M. Strieter，Contrib Microbiol，2006. 13: 170-90 ;Kakinuma，T. and S. T.Hwang，J Leukoc Biol，2006.79 (4):639-51 ;0pdenakker，G. and J.Van Damme，. Int J Dev Biol, 2004. 48 (5-6) :p. 519-27 ；Shields, J. D. , et al. Oncogene, 2007. 26 (21) :p. 2997-3005 ;以及 Soria，G. and A. Ben-Baruch，Cancer Lett，2008. 267 (2) :p. 271-85 〇
[0015] 还发现人和鼠科动物肿瘤分泌各种炎症细胞因子、CXC趋化因子和它 们的受体D Ben_Baruch，A·，Cancer Metastasis Rev，2006. 25 (3):ρ· 357-71; German。，G.，P.Allavena，and A. Man to van i，Cytokine，2008. 43(3) :ρ· 374-9 ; Luboshits，G.，et al，Cancer Res，1999. 59(18) :ρ·4681-7 ;Mantovani，A.，et al，Immunol Today，1992. 13(7):p. 265-70;和 Negus，R.P.，et al，J Clin Invest，1995. 95(5) :p. 2391-6。
[0016] 炎症趋化因子受体例如CXCR4和CCR7常见表达于人乳腺癌中。Muller，A.，et al，Nature，2001. 410 (6824) :p. 50-6。已经证明，阻断CCL21可以减少转移性黑色素瘤细胞 的迁移D Lanati，S.，et al，Cancer Res，2010〇
[0017] 这些结果支持这样一种观点，即炎症趋化因子在触发癌症细胞体内迀移 中发挥重要作用。最近的研究揭示，B16F10黑色素瘤细胞包含的组胺含量比非癌 症黑色素细胞高280倍，而组胺释放在黑色素瘤细胞迀移和生长中是重要的。参 见例如，Davis, S. C.，et al，Inflamm Res, 2010 ；Medina, V. A. and E. S. Rivera, Br J Pharmacol, 2010. 161(4):p. 755-67 ；以及 Medina, V. A. , et al, Free Radie Biol Med, 2009. 46(11) :p. 1510-5。
[0018] 此外，许多生长因子，例如促红细胞生成素（EPO)，已被证明能促进黑 色素瘤和其它癌症细胞的迀移和扩散。参见例如，Mirmohammadsadegh, A.，et al, J Invest Dermatol, 2010. 130(I):p. 201-10 ；以及 Shi,Ζ·，et al, Mol Cancer Res, 2010. 8(4) :ρ· 615-26。
[0019] 一些最近的出版物声称，可以制作纳米球来定位，接着通过局部药物递送或诱 导的免疫反应消灭肿瘤细胞。参见Hara，K.，et al，Oncol R印，2006. 16(6) :ρ· 1215-20; Ruoslahti, Ε. , S. N. Bhatia, and Μ. J. Sailor, J Cell Biol, 2010. 188 (6) :p. 759-68 ； Torchilin，V.P·，Handb Exp Pharmacol, 2010 (197) :p.3_53〇
[0020] 早期检测出转移性癌可以显著影响患癌症个体的预后并确定合适的治疗过程。一 般来说，当检测到原发性肿瘤时，可移除一个或多个附近的（区域性的）淋巴结，并对癌症 扩散到淋巴结进行检测。淋巴结中癌细胞的检测（淋巴结转移的诊断）为确定手术范围或 确定术后化疗提供了有用的信息。但是，即使有癌症细胞存在于淋巴结，如果切片是由无癌 细胞的切割表面制备，并对该切片进行组织诊断，癌细胞仍可被忽略。另外，诊断结果可能 会根据实施诊断的医学病理学者的技术水平不同而不同。此外，癌细胞可能不会出现在附 近的淋巴结，即使癌细胞已转移到远端位置或具有转移的潜力。
[0021] 尽管对癌细胞转移的机制进行了广泛的研究，但是还没有有效的办法来抑制或防 止转移的发展。本领域迫切地需要有效抑制、最小化或防止患者中转移性肿瘤的发展。本 领域还需要检测转移性癌细胞的灵敏且稳健的方法。本发明满足了这些及其他的需要。 [0022] 前面的描述包括了在理解本发明时有用的信息。并不认可此处提供的任何信息是 现有技术或与现在要求保护的发明相关，或具体或间接引用的任何公布是现有技术。
【发明内容】
[0023] 在一个方面，本发明提供了一种癌细胞陷阱（trap)，其中转移性癌细胞迀移并积 聚在癌细胞陷阱中。在一些实施方式中，癌细胞陷阱可选地包含一种或多种生物活性剂。在 一些实施方式中，癌细胞陷阱包含一种或多种化疗剂。在一些实施方式中，化疗剂和/或生 物活性剂从癌细胞陷阱释放。
[0024] 在一些实施方式中，癌细胞陷阱配制成药物组合物，其包含一种或多种药学上可 接受的赋形剂。
[0025] 在一些实施方式中，癌细胞陷阱能够释放一种或多种生物活性剂例如蛋白质、趋 化因子和生长因子。在一些实施方式中，所述释放是在一段时间内受控释放或延长释放，使 癌细胞陷阱中的癌细胞随时间募集和积累。
[0026] 在一些实施方式中，癌细胞陷阱选自由支架结构、水凝胶、微米颗粒和纳米颗粒组 成的组。在一些实施方式中，癌细胞陷阱包含微泡支架。在一些实施方式中，癌细胞陷阱是 组织支架。在一些实施方式中，支架包含可降解聚合物和多肽。在一些实施方式中，支架是 高孔隙度的，能够允许其中的生物活化剂释放和细胞的积聚。
[0027] 在一些实施方式中，癌细胞陷阱包含原位固化的水凝胶。在一些实施方式中，癌细 胞陷阱是由聚乙二醇基于原位胶凝水凝胶制造的。
[0028] 在一些实施方式中，水凝胶包含选自以下物质组成的组的材料：一种或多种聚合 物材料、多糖、聚乙二醇-聚丙烯酸互穿网络（PEG-PAA-IPN)水凝胶、聚乙二醇、细胞外基质 蛋白、纤维蛋白原、水凝胶微米颗粒以及它们的组合。
[0029] 在一些实施方式中，支架包括聚（丙交酯-共-乙交酯）（PLGA)共聚物、白蛋白、 胶原蛋白、明胶、免疫球蛋白、细胞外基质蛋白、纤连蛋白和它们的组合。
[0030] 在一些实施方式中，癌细胞陷阱包含一种或多种生物活性蛋白或分子。在一些实 施方式中，生物活性蛋白或分子选自由以下物质组成的组：IL-1、IL-4、IL-8、IL-10、IL-13、 IL-17、CCL2、CCL5、CCL9、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CCR4、CCR5、CCR7/ CCL21、CCR9、CCRlO、CCL18、CCL2/MCP-l、MIP-la/CCL3、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、 CXCL8、CXCL12/SDF-la、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR7、促红细胞生成素（EPO)、CCL5/RANTES、 肝细胞生长因子激活剂（HGFA)、胰岛素样生长因子-I (IGF-I)、环氧合酶-2 (C0X-2)、 CXCL14、前列腺素 E2、血小板源生长因子、血管内皮生长因子（VEGF)和它们的组合。
[0031] 在另一方面，本发明提供了一种治疗或防止癌症转移的方法，包括给予需要的对 象有效量的本发明癌细胞陷阱，其中转移性癌细胞迀移并积聚在癌细胞陷阱内，从而治疗 或防止对象中的肿瘤转移。
[0032] 在一些实施方案中，癌症干细胞迀移到癌细胞陷阱中。
[0033] 在一些实施方案中，所述癌症选自以下组成的组：黑色素瘤、前列腺癌、白血病、鳞 状细胞癌、星形细胞瘤、卡波济氏肉瘤、成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、头颈部癌、卵巢癌、子 宫癌、乳腺癌、肺癌、神经胶质瘤、大肠癌、泌尿生殖系统癌、胃肠癌、甲状腺癌和皮肤癌。 [0034] 癌细胞陷阱可使用医药领域已知的方法给予对象或患者。在一些实施方式中，癌 细胞陷阱植入对象中。在一些实施方式中，癌细胞陷阱注射入对象中。在一些实施方式中， 所述对象是哺乳类动物，如人。
[0035] 在一些实施方式中，本发明方法可以与任何癌症治疗方法结合。在一些实施方式 中，所述治疗方法选自由手术、化疗和辐照组成的组。
[0036] 在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括使植入或注射的癌细胞陷阱接受辐 照处理，从而杀死已迀移到癌细胞陷阱的转移性癌细胞。在一些实施方式中，在一段时间之 后从患者身上移除癌细胞陷阱。
[0037] 在另一方面，本发明提供了一种检测癌症转移的方法，包括：给予需要的对象一癌 细胞陷阱，其中转移性癌细胞迀移并积聚在癌细胞陷阱中；以及测试癌细胞陷阱中转移性 癌细胞的存在，从而检测对象中的癌症转移。在一些实施方式中，从癌细胞陷阱移除癌细胞 并对其进行评估。在一些实施方式中，从所述陷阱移除细胞，同时该陷阱仍然存在于对象 中。在一些实施方式中，从对象移除癌细胞陷阱，并可选地在评估前移除细胞。
[0038] 应理解的是，前面本发明的大体描述和下面详细的描述都是示例性的，并因此不 限制本发明的范围。
【附图说明】
[0039] 本领域技术人员会理解，下面描述的附图仅用于说明的目的。附图不意图以任何 方式限制本教导的范围。
[0040] 图1.异物反应触发肿瘤细胞迀移。发现预先存在1天的皮下植入物吸引⑶lib. 炎症细胞（A，左）以及腹腔内移植的B16F10黑色素瘤细胞（A，右）的迀移。为确定炎症信 号在癌细胞迀移中的影响，根据实验时间表（B)从6h至2周刺激不同程度的炎症刺激强 度。结果发现，大量CDllb.炎症细胞在12h内募集到植入部位，此后，炎症细胞的汇集减慢。 这些结果描绘了生物材料介导的炎症反应的不同阶段（C)。炎症反应的阶段还影响黑色素 瘤细胞募集的程度（D)。在微球植入后24h左右，植入区域中的黑色素瘤细胞积聚达到高峰 (E)。炎症诱导的癌症转移还用光学成像方法通过用Kodak X-Sight 761近红外纳米球标 记黑色素瘤细胞检测（F)。
[0041] 图2. PLA微球周围的皮下组织的免疫组化染色，其中，该PLA微球采用或不采用地 塞米松（Dex)处理。可观察到（200X)植入PLA微球（A，上左）或用地塞米松浸泡过的PLA 微球（A，上右）的组织中炎症细胞（CDllb.)的积聚。还在植入了 PLA微球（A，下左）或用 地塞米松包埋的PLA微球（A，下右）的组织中观察到（400X)黑色素瘤细胞（HMB45.)的募 集。用作图和统计分析了两种处理的皮下组织中的炎症细胞和黑色素瘤细胞数目的定量 (B)。数据是平均值土 SD (η. 6每组）。*P〈0. 05, t-检验。
[0042] 图3.异物反应和黑色素瘤细胞募集到不同的生物材料植入物的程度。对组织进 行免疫组化染色以评估异物反应的程度，并量化植入物包括PLA、氢氧化铝和Glasperlen 周围的CDllb.炎症细胞和HMB45.黑色素瘤细胞的积聚（A)。将细胞募集的定量分析作图 (B)，并对植入微球的周围组织中黑色素瘤细胞数目和炎症细胞数目之间的关系进行统计 学分析（〇。数据是平均值±30(11.5每组）。扑〈0.05，厶勵￥八。
[0043] 图4.基于免疫组化分析的募集到微球植入区域的B16F10细胞生物分布评价。为 观察生物分布，在PLA微球植入后24h，腹腔内给予表达GFP的B16F10细胞。在淋巴结、脾 和植入区域找到高密度的癌细胞。然而，在皮肤、肺、肝和肾找到相对低密度的癌细胞。
[0044] 图5.响应炎症刺激的癌细胞募集在不同癌细胞类型中是普遍存在的，包括Lewis 肺癌（LLC)、人MDA-MB-231乳腺癌、人PC_3前列腺癌、JHU-31大鼠 JHU-31。包含用无标记 癌细胞移植的PLA植入物的动物用作对照。
[0045] 图6.AMD3100处理抑制了 B16F10黑色素瘤细胞募集到植入部位（A)。但是， AMD3100阻断对淋巴结中的黑色素瘤细胞的积聚没有影响（B)。另一方面，炎症部位积聚的 B16F10黑色素瘤细胞中，CCR7/CCL21途径还通过CCL21中和抗体处理进行检验。相反，月中 瘤细胞迀移到微球植入部位的数目不受影响（C)。但是，淋巴结中B16F10黑色素瘤细胞的 存在大幅减少（D)。*P〈0. 05, t-检验。
[0046] 图7. (A).使用鼠类黑色素瘤转移模型测试EPO和SDF-I α装载的组织支架和对 照支架的黑色素瘤募集能力。实时体内成像显示了组织骨架周围标记的B16F10黑色素瘤 细胞积聚。（B).使用鼠类黑色素瘤转移模型测试EPO和SDF-Ia装载的组织支架和对照支 架的黑色素瘤募集能力。使用Kodak成像系统检测，EPO释放的组织支架显示增强的>1倍 的黑色素瘤细胞积聚。（C)EPO释放的支架大大增强了具有癌症的动物的寿命。*P〈0. 05， 检验。
[0047] 图8.使用释放趋化因子的水凝胶的转移性癌细胞陷阱。
[0048] 图9.癌症转移动物模型示意图。
[0049] 图10.㈧.BSA微泡（MB)用作致孔剂以制造 PLGA支架。光学显微镜下的微泡图 像。（B)BSA MB支架的SEM图像显示了大孔以及蜂巢状的孔壁结构。（C)在BSA MB支架的 几乎所有大孔的壁中都找到显著的蓝色蛋白染色。（D)在不同时间点从MB-IGF-I支架和 IGF-I浸泡过的支架释放的IGF-I的生物活性。
[0050] 图11. (A).基于PEG的水凝胶，用于受控的蛋白释放。室温下流体相的水凝 胶在37°C变成固体。（B)基于PEG的水凝胶，用于受控蛋白释放。不同浓度的水凝胶 (0, 3, vs. 5% )随时间体内释放NIR标记的BSA的图像。（C)基于PEG的水凝胶，用于受控 的蛋白释放。定量结果显示了 PEG化的水凝胶的受控缓慢释放性质。
[0051] 图12. (A-H)明胶MB支架的鉴定。㈧对照（低mag)和⑶明胶MB支架（低mag) 的扫描电子显微镜图像。比例尺：1〇〇 μ m。（C)对照（高mag)和（D)明胶MB (高mag)的 扫描电子显微镜图像。比例尺：50μπι。进行内部横截面的考马斯亮蓝染色以确定（E)对照 和（F)明胶MB支架的内部架构和蛋白位置。（G)