肿瘤干细胞疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及肿瘤干细胞疫苗。
【背景技术】
[0002] 肿瘤是目前已成为一类常见病、多发病，在部分欧美国家，恶性肿瘤的死亡率位 居各类疾病第二位，仅次于心血管系统疾病。据国家癌症中心已统计出的数据显示，截至 2011年我国恶性肿瘤死亡占全部死亡的四分之一，全年新发恶性肿瘤3372175例，死亡病 例2113048例，较2010年有大幅提升，严重威胁人类健康。并且，癌症的发展趋于年轻化， 已成为世界头号"健康杀手"。
[0003] 以免疫治疗为主的生物治疗已经发展成为肿瘤治疗的新模式。免疫治疗一般包 括：细胞因子治疗、过继性免疫治疗、肿瘤疫苗、抗体为基础的免疫治疗、分子靶向治疗等。 其中肿瘤的治疗性疫苗，尤其是肿瘤细胞疫苗、基因工程疫苗等都取得了可喜的进展。疫 苗能够激活机体的自然杀伤细胞（NK)和特异性细胞毒性T细胞（CTL)，产生抗肿瘤的保护 性免疫应答作用，有着广阔的应用前景。但由于肿瘤抗原免疫原性弱、肿瘤免疫逃逸机制 复杂、肿瘤的异质性等原因，疫苗的实际疗效与预期有很大差距，如何提高肿瘤疫苗免疫原 性，激发宿主免疫系统对瘤细胞免疫攻击效应已成为研究内容之一。
[0004] 以整个肿瘤细胞作为抗原来源是肿瘤疫苗发展趋势之一，具有不需鉴定其肿瘤特 异性抗原的优点，但其免疫原性弱、特异性差，因此需要人为的改变其免疫原性或以细胞因 子为佐剂，改变接种部位微环境，激活抗原提呈细胞（APC)，增强免疫反应。而近几年提出 的肿瘤干细胞假说，为人们更深层次上认识了肿瘤的发病、转移、复发的机制。肿瘤干细胞 (cancer/tumorstemcells，CSCs/TSCs)假说认为肿瘤组织细胞群中存在极少量具有自我 更新和无限增殖能力及多向分化潜能的细胞，这群细胞即CSCs。CSCs是肿瘤发生、发展、侵 袭、转移的根源，对恶性肿瘤的治愈有着深远的意义。目前，CSCs的存在已在白血病以及绝 大部分实体肿瘤中得到了证实，CSCs在各种肿瘤疾病中的作用机制已成为目前肿瘤疾病的 研究热点。如用CSCs联合树突状细胞（DC)免疫小鼠后，能拮抗野生型肿瘤细胞的攻击，表 现出明显的抗肿瘤效果。
[0005] 研究表明CSCs比非CSCs表现出更高的耐药性，是其重要特征之一，也是肿瘤治疗 失败的重要原因之一。研究报道指出肿瘤细胞经放疗后转化成为CSCs，其增殖能力更强， 恶性程度更高。另外还有研究指出，多种信号通路分子如TGF-P、IGF-I、Notch-1等参与 了CSCs对化疗的耐受。肿瘤的耐药、转移、复发等特征都可能与CSCs有关，也是导致肿瘤 治疗失败的重要原因。因此肿瘤治疗成功的关键就是能否彻底消灭CSCs。以CSCs为治疗 靶点，既要杀灭CSCs，同时又要保护机体正常干细胞。
[0006] 有报道指出ALDH1+细胞为乳腺癌CSCs标志物。另外OCT-4、USP22、a-2 0lhi、 Nanog等分子都是已发现的CSCs表面标志分子。大部分已经被鉴定出来的CSCs胞都具有 其特定的表面分子标志，然而不同组织来源的CSCs的表面标志却不尽相同，存在一定的相 对性：1)同一种CSCs在不同分化状态和不同环境中可能具有不同的表面分子标志，如肝癌 CSCs，有研究认为⑶133+肝癌细胞为肝癌CSCs;而有研究认为⑶90+⑶44+肝癌细胞也是 肝癌CSCs;2)同一种表面分子标志不一定是所有CSCs的表面标志，如乳腺癌CSCs胞表面 标志为⑶24-/l〇W，胰腺癌干细胞为⑶24+，脑肿瘤CSCs则为⑶133+ ;3)同一种表面标志 在同一肿瘤的不同细胞系中所占比例相差很大，喉癌H印22细胞系中的CD133+CSCS只有 〈5%。对CSCs表面分子标志的深入研究，将具有特定分子标志的细胞分尚出来，进一步研 究CSCs的特性及相关调控机制，将对肿瘤的诊断和治疗提供重要帮助。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的第一方面技术问题是提供一种肿瘤干细胞疫苗。
[0008] 为解决上述问题，本发明的技术方案是：肿瘤干细胞疫苗，其特点在于，其通过将 重组质粒pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21转染肿瘤干细胞，得到肿瘤干细胞疫苗。
[0009] 本发明的一优选技术方案中，所述肿瘤干细胞为小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细 胞。
[0010] 本发明的一优选技术方案中，转染后的肿瘤干细胞根据其表面分子标志进行进一 步筛选。
[0011] 其中，所述表面分子标志包括⑶133+，⑶44+。
[0012] 本发明所要解决的第二方面技术问题是提供一种肿瘤干细胞疫苗的制备方法。
[0013] 为解决上述问题，本发明的技术方案是：肿瘤干细胞疫苗的制备方法，其特点在 于，将重组质粒pIRES-ESAT-6-gpi/IL-21通过脂质体转染肿瘤干细胞，并筛选稳定转染 株。
[0014] 本发明的一优选技术方案中，转染后的肿瘤干细胞根据其表面分子标志进行进一 步筛选。
[0015] 本发明的一优选技术方案中，所述肿瘤干细胞为小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细 胞。
[0016] 本发明的一优选技术方案中，所述表面分子标志包括⑶133+，⑶44 +。
[0017] 本发明的一优选技术方案中，转染后的肿瘤干细胞通过免疫磁珠法分选具有特定 表面分子标志的肿瘤干细胞。
[0018] 本发明所要解决的第三方面技术问题是提供一种前述肿瘤干细胞疫苗在制备治 疗抗肿瘤药物中的用途。
[0019] 本发明选择小鼠黑色素瘤细胞系B16F10细胞，将构建好的pIRES-ESAT-6-gpi/ IL-21通过脂质体转染B16F10细胞并筛选稳定转染株。然后从中分选出 B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CD133+CD44+CSCs免疫C57BL6小鼠，研究其免疫效应与拮抗肿 瘤效应。
[0020] 肿瘤细胞疫苗往往免疫原性很低，单独使用自体或异体的肿瘤细胞作为瘤苗，难 以诱发足够强度的免疫反应。有研究指出[8]，采用基因工程方法将CD80、CD86基因导入 肿瘤细胞中，通过提供T细胞活化的第二信号来打破肿瘤的外周免疫耐受，而将编码IL-2、 IL-12等细胞因子基因导入肿瘤细胞，可改变肿瘤组织局部免疫微环境，解除肿瘤局部免 疫细胞的抑制状态，发挥抗肿瘤免疫效应。另有研究[9]将卵清蛋白0VA的编码基因导入 MCA101细胞，外源基因的表达打破肿瘤诱导的免疫耐受并可产生抗肿瘤免疫反应。我们先 前制成小鼠黑色素瘤瘤苗，膜表达"异种抗原"ESAT-6,可诱导免疫鼠产生对ESAT-6的免疫 反应，打破机体对肿瘤的免疫耐受；同时瘤苗在接种部位分泌表达IL-21，诱导并增强机体 产生抗肿瘤免疫应答。
[0021] 在本发明中，我们首先将编码ESAT-6和IL-21的基因的重组质粒导入B16F10细 胞，制备出小鼠 B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗，并对 B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤苗进行 了鉴定。从IF显微镜、FCM和Westernblot检测实验结果可以看出，B16F10-ESAT-6-gpi/ IL-21瘤苗细胞膜表达ESAT-6-gpi，并分泌表达IL-21，表明B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21瘤 苗制备成功。因ESAT-6具有较强的细胞和体液免疫活性，可诱导IFN-y产生，能使机体产 生以Thl为主的细胞免疫应答及特异性IgG。IL-21则可增强荷瘤鼠CTL、NK细胞等抗肿 瘤活性，促进NK细胞杀伤反应向特异性CTL反应转变，诱发小鼠抗肿瘤免疫应答。随后从 中分选CD133+CD44+B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CSCs瘤苗。由于大部分已经被鉴定出来的 CSCs都具有其特定的表面分子标志，然而不同组织来源的CSCs的表面标志却不尽相同。根 据以前研究报道，本研究仍选定⑶133、⑶44作为黑色素瘤B16F10干细胞的表面标志，采用 免疫磁珠分选技术，分选出B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CD133+CD44+CSCs。经鉴定，分选纯 度达到95%以上，且分选效率与实际CSCs数相吻合。
[0022] 本发明中 B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21构建与鉴定和 B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21 CD133+CD44+瘤苗的分选成功，为下一步研究B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CD133+CD44+CSCs 瘤苗免疫效应与抗肿瘤效应以及机制的研究奠定了基础。
【附图说明】
[0023] 图1为RT-PCR鉴定ESAT-6和IL-21基因的转录表达；其中，1泳道：DNAMarker; 2泳道：GAPDH基因片段；3泳道：gpi基因片段；4泳道：ESAT-6基因片段；5泳道：IL-21基 因片段；
[0024] 图2A为IF显微镜检测显示B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞瘤苗表 达ESAT-6-gpi;注：A左侧为荧光显微镜，右侧为光镜；1、2 :B16F10细胞；3、4 : B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞瘤苗；
[0025]图 2B为FCM检测 ESAT-6-gpi表达。
[0026]图 3 为Westernblot检测 IL-21表达，其中，1 :B16F10细胞；2 : B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞；
[0027]图 4 为磁珠分选CD133+CD44+B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21CSCs，其中，图 4A为 B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞表面CD44、CD133分子表达情况；图4B为磁珠分选前后瘤 苗细胞中⑶133+⑶44+细胞比例变化；
[0028] 图5A为免疫鼠肿瘤生长情况；其中，1 :B16F10细胞免疫组；2 : B16F10CD133+CD44+CSCs免疫组；3 :B16F10-ESAT-6-gpi/IL-21细胞免疫组；
[0029] 图5B为免疫鼠肿瘤生长情况曲线图；
[0030] 图6为不同瘤苗