Faecalibacterium prausnitzii HTF-F（DSM 26943）在抑制炎症中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物，特别涉及免疫学和胃肠病学。具体的，本发明涉及益生菌及 其提取物用于治疗炎性失调（诸如炎性肠病和与微生物群失衡相关的疾病）的治疗用途。 本发明还提供了抗炎性（益生菌）组合物，例如功能性食物、营养物或药物组合物，以及生 产它们的方法，以及促使肠道内的益生菌生存的途径。
【背景技术】
[0002] 炎性肠病（IBD)是胃肠道的慢性炎性失调，其特征有腹泻、血便、腹痛和体重下 降。IBD是起因未知的慢性复发性炎症。IBD包括两种主要的病情：溃疡性结肠炎（UC)和 克罗恩氏病（Crohn'sdisease，⑶）。UC主要影响大肠或结肠的粘膜层。相比之下，⑶ 被定义为透壁的肉芽肿性炎症，可涉及小肠和大肠的几段。UC和CD由在遗传易感性宿主 体内针对肠道微生物群的异常炎性T细胞应答所驱动。微生物群在多样性和组成中的极 al.2009)。在IBD患者的排泄物微生物群中已经观察到拟杆菌门（Bacteroidetes)和厚壁 菌门的出现率降低，而变形菌门和放线菌门的出现率增加（Frank，StAmandetal. 2007)。 尤其是，Faecalibacteriumprausnitzii(普氏奠杆菌），厚壁菌门中的一员并且是健康 人类结肠中最丰富的种类之一（Flint,Scottetal. 2012)，而在IBD患者的微生物群中 不足（Sokol，Seksiketal. 2009)。与缓解期患者体内相比，来自回肠活检的粘膜相关的 F.prauznitzii计数在患活动性疾病的⑶患者体内较低（Sokol,Pigneuretal. 2008)。
[0003] 据报道，F.prausnitzii是抗炎性细菌，因为它具有诱导人类外周血单核细 胞（PBMC，（Sokol,Pigneuretal.2008))中大量的IL-10以及树突细胞的能力。进一 步地，据报道，使用F.prausnitzii的培养上清液处理Caco-2细胞降低了IL-1 0诱导 的NF-kB的活化和IL-8的分泌。这归功于分泌到培养基中的一种还未被鉴定出的因子 (Sokol,Pigneuretal.2008)。此外，已经不出给予F.prausnitzii菌株A2-165 及其培养 上清液，可在小鼠中预防2, 4, 6-三硝基苯磺酸（TNBS)诱导的结肠炎（Sokol,Pigneuret al. 2008)。这一模型被认为与⑶类似，因为所产生的粘膜性炎症在IFN-y、TNF-a和IL-12 的过量产生下由1型T辅助细胞（Thl)应答介导。
[0004] 本发明人认识到，需要更多的F.prausnitzii菌株用于炎性失调的预防和/或治 疗中。他们的目的特别在于鉴定一种比在现有技术中使用的菌株A2-165(DSMZ17677)更 有效的菌株。进一步的目标是提供具有抗炎性特性的细菌提取物。为了实现这一目的，评 价了F.prausnitzii的不同菌株及其提取物在小鼠葡聚糖硫酸钠（DSS)结肠炎模型中抑制 炎症的能力。
[0005] 令人惊奇的是，发现F.prausnitzii菌株HTF-F的活细胞以及在其中分离的细胞 外聚合物基质（EPM)具有很强的免疫调节性质。申请人于2013年3月1日将该菌株保藏在 德国微生物菌种保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen， DSMZ)，登记号为DSM26943。之前，菌株HTF-F作为从健康人类供体获得的几种新的分离 物之一已经在Lopez-Silesetal. (2012)中已经进行了报道。基于对16SrRNA的序列分 析，发现它属于遗传谱系II。但是，在本领域的现有技术中还没有报道或暗示菌株HTF-F的 治疗应用，更不用说它在IBD中具有很强的抗炎性效果了。
[0006] 重要的是，本发明发现HTF-F的抗炎性效果比菌株A2-165更有效，这部分是因为 HTF-F的EPM的免疫调节性质。EPM的免疫调节效果至少部分通过在抗原递呈细胞中产生 细胞因子IL-12和IL-10的TLR2依赖性调节来介导。还观察到，菌株HTF-F进行细胞间聚 集并且在液体培养基中形成致密的生物膜，而菌株A2-165不会。不希望受到理论束缚的情 况下，生物膜可为体内的细菌定植提供一些优势。尤其是，EPM可保护细菌免受氧化应激， 因此可存在于靠近肠道上皮处，而肠道上皮是经由其向内扩散的氧的主要来源，优于产生 较少EPM的菌株。这会帮助在接近结肠壁处递送丁酸盐和其它抗炎性产物。所有这些特征 使得F.prausnitzii菌株HTF-F成为强有力的益生菌，以治疗结肠炎和其它炎性肠道疾病。 因此，F.prausnitziiHTF-F及其EPM都有利地用于处置IBD和相关的炎性疾病中的治疗。
【发明内容】
[0007] 相应地，在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括作为活性成 分的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其含有细胞外聚合物基质的提取物，和 可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。该组合物，例如，是药物组合物、食物组合物或营养物组合 物。本发明还提供用作药剂的F.prausnitzii菌株HTF-FDSM26943 (下文也称作"HTF-F"） 和/或其含有细胞外聚合物基质的提取物。例如，HTF-F或含有细胞外聚合物基质的HTF-F 提取物有利地用于治疗或预防哺乳动物受试者胃肠道的炎性失调的方法中。这在下文中例 示为小鼠结肠炎模型中的临床参数的减小。
[0008] 本发明还提供了一种治疗或预防与哺乳动物受试者的胃肠道炎性失调相关的症 状的方法，该方法包括给予有效量的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F或其含有 EPM的提取物。
[0009] 根据本发明，Faecalibacteriumprausnitzii菌株可以是存活细胞的形式。或者， 它们是非存活细胞的形式。还设想是存活细胞和非存活细胞的混合物。通常益生菌以存活 细胞的形式使用。但是，也可延伸至非存活细胞，诸如被杀死的培养物或含有由益生菌表达 的有益因子的组合物。这可包括热杀死的微生物，或通过暴露于改变的pH或经压力或Y 辐照杀死的微生物。细胞可被加入到药物中。与存活细胞相比，使用非存活的细胞，特别在 考虑到它的氧敏性时，产品制备更加简单且储存需求的限制少很多。
[0010] 在具体的方面，例如通过直肠内递送，将活的细菌或EPM直接给予到胃肠道内。 非细菌递送的其它选择包括不依赖于肠道的途径，包括系统性递送（诸如通过腹腔内注 射）。在本发明的优选实施方式中，细菌的一种或多种经纯化的、不会在宿主细胞内引发炎 性应答的抗炎性组分例如，经口、皮下或局部地给药。
[0011] 考虑到它的强抗炎性效果，本发明发现它在涉及不想要的炎性应答的各种病理学 中的应用。炎症可被归类为急性炎症或慢性炎症。急性炎症是身体对有害刺激的初始应答， 并且通过增强血浆和白血球（特别是粒细胞）从血液中向受伤组织中的移动来实现。生化 事件的一系列步骤传送了炎性应答并且使其成熟，这涉及局部脉管系统、免疫系统和在受 伤组织内的各种细胞。长期炎症（也称为慢性炎症）导致在炎症位点处存在的细胞类型发 生渐进式改变，并且特征是来自炎性过程的组织同时发生破坏和愈合。
[0012] 在一个实施方式中，炎性疾病是炎性肠胃失调，优选选自由炎性肠病、克罗恩 氏病、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、乳糜泻、感染性结肠炎（例如由艰难梭状芽孢杆菌 (C.difficile)引起）、溃疡性结肠炎、其它肠道相关疾病，及它们的任意组合组成的组。或 者，炎性疾病是炎性自身免疫性疾病，其中异型性增生-平衡的微生物群和低级的粘膜炎 症与疾病（诸如糖尿病（I型和II型）、哮喘和特应性疾病）的病原学或发作相关。
[0013] 在另一方面，菌株HTF-F和包含它们的组合物用作患有与肠道微生物群失衡相关 的症状或失调，或具有发展成这些症状或失调的风险增加的人的预防性或治疗性试剂。肠 道微生物群组成已与代谢综合征（例如肥胖、II型糖尿病、心血管疾病和非酒精性脂肪性 肝炎）的几个标志相关联。越来越多的证据表明，肠道微生物群促使低级炎症的发作，该低 级炎症的特征是经由与肠道屏障功能障碍相关的机制引起这些代谢失调。目前，已经示出， 肠内分泌细胞和内源性大麻素系统控制肠道通透性和代谢性内毒素血症。而且，在此背景 下使用具有益生元性质的不易消化的碳水化合物的定向营养干预已经在临床前研究中示 出了有希望的结果，尽管人类干预研究是进一步研究的根据。因此，本发明的组合物有利地 用于建立或维持平衡的肠道微生物群。进一步地，在肥胖和II型糖尿病的背景下，HTF-F可 用于改变作为治疗靶点的肠道微生物群。
[0014] 人们越来越认识到肠道微生物群与能量稳态和炎症及其在肥胖相关失调的发病 机理中的作用之间的关系。肥胖动物模型将改变的微生物群组成通过以下几种机制与宿主 体内的肥胖的发展、胰岛素耐受性和糖尿病关联起来：由饮食增加的能量收集，脂肪组织和 肝脏中的改变的脂肪酸代谢和组成，肠肽YY和胰高血糖素样肽（GLP) -1分泌的调节，脂多 糖toll样受体4轴的活化，以及GLP-2对肠道屏障完整性的调节。
[0015] 在优选的实施方式中，菌株HTF-F或其含有抗炎性试剂的提取物用于保护大肠或 结肠的粘膜层或治疗对大肠或结肠的粘膜层所造成的伤害。
[0016] 优选地，要经受治疗的受试者是人类受试者，例如是已知患有或怀疑患有溃疡性 结肠炎的人类受试者。但是，本发明还可应用于兽医学。例如，还可提供Feacalibacterium prausnitzii菌株HTF-F或其提取物用于家畜或农畜的治疗应用。
[0017] F.prausnitzii菌株HTF-F或其提取物优选增加受试者体内抗炎性细胞因子的产 生，和/或减少受试者体内一种或多种促炎性细胞因子的产生。例如，抗炎性细胞因子是 IL-10或TGFP。在一个实施方式中，促炎性细胞因子依赖于TLR2信号传导，所述细胞因子 优选是IL-12p70。
[0018] 我们还描述F.prausnitzii菌株HTF-F或其提取物用于制备预防和/或治疗不期 望的炎症活性的抗炎性生物治疗试剂，或用于制备预防和/或治疗不期望的炎症活性的抗 炎性生物治疗试剂。所述菌株可通过对抗来自胃肠道的促炎性微生物和从胃肠道排除促炎 性微生物来起作用。
[0019] 细菌或提取物经配制，以治疗有效量给予受试者，这依赖于例如受试者的类型、疾 病严重程度和给药途径。典型地，细菌的治疗有效量是约10exp6CFU/天至lOexpllCFU/天， 优选 10exp7CFU/ 天至lOexplOCFU/ 天。
[0020] 可经由任何适当的给药途径给予细菌。例如，可以经口摄取的形式将本发明的特 定的Faecalibacteriumprausnitzii菌株给予动物（包括人类）。在食物组合物或营养物 的情况中，细菌可简单地添加到传统食品（fooditem)或食物补充剂中。示例性的药物制 剂包括胶囊、微囊剂、片剂、颗粒剂、粉剂、锭剂、丸剂、栓剂、混悬剂和糖浆剂。在另一实施方 式中，所述组合物是向动物（包括人类）进行直肠给药的形式，例如作为直肠栓剂或灌肠 剂。适当的制剂可通过使用常规有机和无机添加剂的通常采用的方法来制备。药物组合物 中的活性成分的量可为显示出期望治疗效果的水平。
[0021] 所述组合物可含有任何有用的其它成分，诸如已知支持有益细菌的生长或维持， 以便以有益的方式改变胃肠微生物群落的成分。这样的成分被称为"益生元"。已知的益生 元的典型实例是低聚糖，诸如低聚果糖和菊粉。合生素指：以协同的方式将益生菌和益生元 组合在一起的营养补充剂。
[0022] 上述抗炎性效果所需的F.prausnitzii细菌对氧极度敏感，并且在暴露于环境空 气超过几分钟就不能存活下来。因此，迄今为止，除了它们的有希望的治疗应用外，还没有 描述含有存活的F.prausnitzii的益生菌组合物。
[0023] 本发明的具体方面涉及一种合生素组合物，该合生素组合物包含与以下物质混合 的Faecalibacteriumprausnitzii菌株HTF-F:核黄素、核黄素磷酸盐或其生理学上可接 受的盐，和半胱氨酸。本发明发现上述混合物令人惊奇地使这些细菌在制造、储存和/或消 耗的过程中暴露于环境空气时受到很好的保护。例如，它可经受环境空气暴露达至少24h， 并且在模拟的胃肠液中稳定达至少2h。而且，当与食品（例如奶或乳酸菌饮料）混合时，本 发明的合生素制剂可稳定至少2h。优选使用核黄素。
[0024] 基于所述组合物的总干重，核黄素、核黄素磷酸盐或其生理上可接受的盐以至少 0.05%、优选至少1%、更优选至少2%的量存在。例如，基于所述组合物的总干重，可含有 0.05%至10%、优选1%~10%，如2%~10%或0.05%~0.25%。基于所述组合物的总 干重，半胱氨酸优选以至少0.05%的量存在。适于使用高至2%的半胱氨酸含量。例如，基 于所述组合物的总干重，所述组合物可含有0. 1%~1.5%、0. 5%~1%或0.05%~0.2% 的半胱氨酸。
[0025] 所述组合物可进一步包含一种或多种益生元，优选低聚糖，更优选低聚果糖、果胶 和/或菊粉或菊粉型低聚果糖，它们的量优选是基于所述组合物的总干重的2%~10%。其 它适当的成分包括填充剂，该填充剂的量优选是基于所述组合物的总干重的40%~65%。
[0026] 当然，所述组合物可含有其它有用的成分，包括其它益生元和/或益生菌。有 用的益生菌优选选自由乳酸菌、双歧杆菌或其混合物组成的组。益生菌可以是具有已证 实的益生菌特征的任何乳酸菌或双歧杆菌。例如，它们还可促进双歧杆菌肠道微生物群 的发展。在一些情况中，它们还可辅助保护F.prausnitzii免受氧的影响。适当的其他 益生菌可选自