一种天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及含天然蛋白/PCL纳米纤维成分电纺膜的制备及其在细胞培养及组织工程的基础研究及应用，属于生物医药，组织工程学，细胞生物学，干细胞生物学，生物材料学及心脏大血管外科领域。
【背景技术】
[0002]缺血性心脏病作为我国主要健康问题之一，给我国及世界其他国家带来了沉重的经济负担。尽管目前的药物，介入以及外科手术治疗缺血性心脏病可以有效的改善心肌供血，挽救濒死心肌，可是对于已经造成死亡的无功能心肌并没有修复作用。大面积的心肌死亡可引起的严重的心律失常、心衰以及心脏骤停。对于晚期心脏病的治疗，目前较为有效的方法是心脏移植。但是心脏移植的供体数量少，强烈的免疫排斥反应等因素增加了其医疗成本并导致其很难在临床上大范围应用。
[0003]心肌细胞作为心脏组成的基本单元是参与完成心脏一系列复杂功能的物质基础。已有研究报道称，应用成体干细胞移植的方法可以治疗小鼠缺血性心脏病，包括改善心梗后射血分数，阻止左心室重构，以及通过干细胞的分化增加心肌细胞数量。因此干细胞移植技术受到了越来越多的关注，为治疗缺血性心脏病提供了一种全新的治疗前景。
[0004]干细胞分类多样，来源广泛。骨髓干细胞在心肌再生及心脏损伤修复中已有广泛的报道。其中，c_kit+骨髓干细胞移植入小鼠体内可减少小鼠心梗面积，提高左心室射血分数，并且在小鼠心梗周边区还出现了新生心肌。这些研究提示恰当的移植方式以及正确的干细胞选择可以促进梗死区域心肌细胞的再生以及濒死区心肌的再血管化。
[0005]血管内注射和心肌原位注射是目前干细胞移植修复受损心肌的主要方法。血管内注射是一种创伤小，操作简单的治疗方法，但是血管内注射干细胞后，干细胞归巢的数量，免疫排斥反应等因素制约了其疗效。而心肌原位注射的方法虽然可以保证一定数量的干细胞存在在受损心肌的局部，但是由于其损伤心肌的正常组织结构并且注射部位局限等因素大大限制了其广泛的临床应用。而心肌细胞是存在于大量外基质(ECM)中的，其主要成分是心肌间隙中成纤维母细胞产生和分泌的胶原蛋白及弹性纤维，这些细胞外基质对维持心脏正常的形态和功能起重要作用，心肌胶原纤维相互交织，形成多层次、多方位、复杂的三维空间结构，在支持、保护心肌细胞、协调心肌收缩、舒张等方面发挥重要作用。因此，为骨髓干细胞建立一种类似心肌基质的环境将更加有利于其对心肌缺损的修复。
[0006]在目前的研究中，聚己内酯(Polycaprolactone，PCL)作为由ε-己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族聚酯，具有良好的热稳定性、生物降解性、半结晶性、力学性能、药物通透性和生物相容性，常被用于心肌组织工程。通过干细胞移植，形成“支架材料-干细胞”复合体，治疗心肌梗死。但是由于心肌是一种纳米级别的片层状机构，传统的支架无法准确模拟心肌基质环境。因此，本发明通过静电纺丝技术简单快速的制备纳米纤维，利用其超微结构不仅可以模拟心肌细胞外基质环境，促进细胞向纤维膜内生长，而且较大的比表面积增强细胞间的相互接触，利于细胞之间的相互作用。
[0007]心肌组织细胞外基质最主要的构成组分即胶原蛋白及弹力蛋白。因此本发明创立了应用静电纺丝技术将天然蛋白(胶原蛋白/弹力蛋白)与聚酯类材料聚己内酯(PCL)制成纳米纤维膜，利用天然蛋白对脂肪族聚酯类材料聚己内酯(PCL)的疏水性进行改性，增强聚合物材料对细胞的粘附，从而更充分的模拟心肌细胞外基质环境。该纳米纤维具有良好的生物相容性与力学性能，可以从结构和成分仿生两方面改善干细胞移植治疗心肌梗死的治疗效果，从而实现“支架材料-干细胞”复合体的生物功能性。因此，本发明提出:将天然蛋白(胶原蛋白/弹力蛋白)与聚己内酯(PCL)制成电纺膜，复合骨髓C_kit+干细胞种制成“支架材料-干细胞”复合体-心肌复合补片，修复受损心肌，改善心梗后心功能。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种可模拟心肌细胞外基质环境的天然蛋白组分复合PCL纳米纤维电纺膜并通过种植干细胞制备心肌补片从而修复受损心肌，达到治疗心肌梗死的目的。
[0009]为了达到上述目的，本发明提供了一种天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜，通过将天然蛋白和聚己内酯混合配制纺丝液，经电纺而成，所述的天然蛋白包含天然弹力蛋白(elastin)和天然胶原蛋白(collagen)。
[0010]本发明还提供了上述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜的制备方法，其特征在于，包括:将天然弹力蛋白和天然胶原蛋白按照质量比1: 9?3: 7混合成天然蛋白混合物，将所述的天然蛋白混合物与聚己内酯按照质量比2: 8?8: 2混合，溶于六氟异丙醇或三氟乙醇中，搅拌，得到纺丝液，电纺，所述的电纺条件为:电压为15kV，接收距离为12.5cm，注射速率为1.2ml/h，环境温度为室温，相对湿度为20-80%，得到天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜。
[0011]优选地，所述的搅拌为采用磁力搅拌器搅拌24h。
[0012]优选地，所述的天然蛋白混合物与六氟异丙醇或三氟乙醇的质量体积比为15%(0.15g/ml)(以 g/ml 计)。
[0013]优选地，所得的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜经干燥、消毒备用。
[0014]本发明还提供了上述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用。
[0015]优选地，所述的组织工程移植物为用于修复缺血性心肌损伤、改善心脏功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重构的组织工程移植物。
[0016]优选地，所述的组织工程移植物为用于修复其他除心脏缺损外的组织缺损疾病的组织工程移植物。
[0017]本发明还提供了上述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜作为细胞体外培养介质中的应用。所述的细胞体外培养介质可用于提供促进细胞黏附、存活、增殖的微环境及模拟心肌细胞外基质构架。
[0018]本发明还提供了一种心脏补片，其特征在于，包含种子细胞以及上述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜。
[0019]优选地，所述的种子细胞为骨髓来源的c_kit+干细胞、骨髓单个核细胞、间充质干细胞、心肌去分化细胞、心肌干细胞及胚胎干细胞来源的细胞中的至少一种。
[0020]优选地，所述的骨髓C_kit+干细胞为小鼠骨髓来源的C-kit+干细胞，其制备方法包括:取心梗3天后的小鼠的股骨和胫骨，用Hanks平衡盐溶液冲出骨髓，分离出骨髓单个核细胞，磁珠分选得到c_kit+干细胞。
[0021]本发明还提供了上述的心脏补片的制备方法，其特征在于，包括:将种子细胞种于上述的天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜上，培养得到心肌补片。
[0022]本发明验证了此心脏补片对心功能的修复状况以及含天然蛋白和可降解高分子物质的电纺膜作为模拟心肌细胞外基质环境为干细胞体外培养提供促进细胞粘附，存活，增殖的场所和细胞外基质骨架。
[0023]与现有的技术相比，本发明的有益效果是:
[0024]1.本发明将含有心肌组织细胞外基质成分的天然蛋白和人工合成的可降材料混合，通过静电纺丝技术快速，有效的制成纳米纤维膜，具有操作简单，材料易获得，制作成本低廉的优势。确保今后商品化的可能。利用天然蛋白与人工合成可降解材料的各自优点，不仅保留良好的生物力学性能，而且充分模拟心肌细胞外基质环境。从结构和成分两方面进行仿生模拟，改善干细胞移植治疗心肌梗死的治疗效果。因此可以作为细胞外培养介质提供促进细胞粘附，存活，增殖的细胞外基质微环境。
[0025]2.已有文献报道，骨髓C_kit+干细胞可以向心肌细胞，血管平滑肌，内皮细胞方向分化，并在缺血性心脏病中发挥治疗作用。但是有报道称骨髓C_kit+干细胞在体外增殖能力差，存活时间短。本发明中含有天然蛋白和人工合成可降解材料的静电纺丝在体外可以促进骨髓C_kit+干细胞的大量增增值，从而为细胞移植制造足够多数量的种子细胞。本发明首次提出将骨髓C_kit+干细胞种植于含有天然蛋白成分和可降解物质混合的电纺膜上制成心脏补片。
[0026]3.本发明中还发现含有天然蛋白成分和可降解物质混合的电纺膜在体外具有促进细胞粘附、增殖的作用，移植到心梗心肌表面可以有效改善心梗后心功能，组织左心室重构，起到缺血性心脏病的干细胞治疗作用。
【附图说明】
[0027]图1为对照组以及天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜的电镜照片；(放大倍数1.5k 倍)
[0028]图2A为各天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜的接触角图片；图2B为各天然蛋白/聚己内酯纳米纤维电纺膜接触角统计图；#，&，*代表与20%天然蛋白(NP)组，50%天然蛋白(NP)组中相同天然蛋白配比形成的电纺膜以及对照组相比P< 0.05。
[0029]图3为各组分电纺膜中天然蛋白配比比例弹力蛋白与胶原蛋白