长非编码核糖核酸nonratt021972小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发神经病理痛药物中 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及糖尿病并发神经病理痛药物用途发明领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（DiabetesMellitus，DM)是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人 们生活水平的提高糖尿病的患病率逐年升高，在发达国家糖尿病患病率已达3 % -7 %，成 为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4位需要优先考虑的疾病，已成为世界第5位死 亡主因。糖尿病分为1型（胰岛素依赖性）和2型（非胰岛素依赖性）糖尿病。据估计， 全球六个人里面就有一个人处于患糖尿病并发症的危险中。我国糖尿病人群的构成以2型 糖尿病为主，占糖尿病人群的90%以上，严重影响着人民健康和社会发展。糖尿病神经病变 是常见的糖尿病并发症之一，其最常见的神经病变类型是周围神经损伤，如手，足。糖尿病 是低度炎性疾病，炎性物质可加重糖尿病并发神经损伤。糖尿病并发的周围神经病变以感 觉异常为主，其中以疼痛最痛苦、最显著。临床多见于血糖控制不佳的患者，常表现为远端 肢体自发性疼痛、痛觉过敏、异常性疼痛（如烧灼感、蚁走感或针刺感）等，对于这些异常性 感觉的治疗方法很局限，严重时导致终身残疾。因此，对于糖尿病神经病理痛的防治工作已 成为糖尿病研究领域的热点和重点。
[0003] 在19世纪70年代初Burnstock提出"嘌呤能神经学说"后，作为神经递质的ATP 的研究工作倍受关注。嘌呤类物质包括三磷酸腺苷（ATP)以及其代谢产物二磷酸腺苷/ 一 磷酸腺苷（ADP/AMP)和腺苷等均参与信息传递。胞外核苷酸的受体称为P2受体，ATP及其 类似物作用于P2受体。P2受体分为配体门控性离子通道型受体（P2X受体）和G蛋白偶联 型受体（P2Y受体）。目前已克隆出7种P2X受体亚型（P2XpP2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、 P2X7)和 8 种P2Y受体亚型（PSYpPSYpPSYpPSYpPSYmPSYmPSYmPSYM)。疼痛、伤害性 刺激使损伤细胞、应激细胞和感觉神经末梢释放大量ΑΤΡ，ATP及其作用的P2X受体涉及痛 觉及伤害性信息在初级感觉神经元的传递。其中主要是P2X3受体参与初级感觉神经元的 痛觉及伤害性信息传递。基因敲除P2X3受体或应用选择性P2X3受体拮抗剂A317491可降 低P2X3受体的表达减轻模型动物神经病理痛痛行为。
[0004] 随着基因组测序计划的完成以及新一代深度测序技术的应用，人们发现哺乳动物 细胞中多于95%的转录序列为非编码核糖核酸（noncodingRNA，ncRNA)。非编码RNA是一 类不编码蛋白质但具有生物学调控功能的RNA分子，它可通过参与mRNA的稳定和翻译水平 的调节、蛋白质的运输、RNA的加工和修饰以及影响染色体的结构等机制，调控生物体的基 本生命活动，同时与一些重要疾病的病理生理过程相关。非编码RNA包括短非编码核糖核 酸（包括siRNA、miRNA、piRNA)和长非编码核糖核酸（longnon-codingRNA,IncRNA)。长 度大于200个碱基（200nt)为长链非编码RNA(lncRNA)。目前长度小于50个核苷酸的非编 码RNA(如microRNA、siRNA和piRNA)等的研究已取得突破性进展，但对具有功能的长非编 码RNA的研究不多。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的第 一个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸在制备治疗糖尿病并发 神经病理痛疾病药物中的应用。
[0006] 本发明的第二个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的第 二个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸在制备糖尿病并发神经 损伤疾病药物中的应用。
[0007] 本发明的第三个目的在于提供长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA的第 三个新用途，即长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰核糖核酸在制备治疗糖尿病并发 感觉神经炎性相关疾病药物中的应用。
[0008] 本发明用SOLiD高通量测序并通过生物信息学预测和分子生物学验证确定大鼠 背根神经节（DRG)存在长非编码核糖核酸N0NRATT021972[http://www·noncode·org]，并 发现糖尿病模型大鼠背根神经节长非编码核糖核酸N0NRATT021972表达较对照组明显增 加，提示背根神经节的长非编码核糖核酸N0NRATT021972与糖尿病引发的感觉神经病理变 化有关。
[0009] 本发明通过2型糖尿病大鼠模型，观察长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰 RNA处理后2型糖尿病大鼠痛行为的变化，以及与介导神经病理痛的？2心受体表达变化的 关系，为长非编码核糖核酸N0NRATT021972小干扰RNA用于糖尿病并发神经病理痛的预防 和治疗提供帮助。
[0010] 长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸处理后同时可下调2型糖尿 病大鼠背根神经节P2X3受体的表达，降低糖尿病大鼠血清中细胞炎性因子一肿瘤坏死因子 (TNF-α)的含量，增加糖尿病大鼠血清中过氧化氢酶（CAT)和超氧化物歧化酶（S0D)的活 性。因此，长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰核糖核酸可能通过减少TNF-a的释 放、增加超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性、降低2型糖尿病神经病理大鼠背根神经节 P2X3受体的表达、抑制背根神经节P2X3受体介导的伤害性信息传递，减轻2型糖尿病神经 病理痛大鼠的痛行为。
【附图说明】
[0011] 图1为2型糖尿病大鼠制模过程中的机械缩足反射阈值变化图。长非编码核糖核 酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理后对2型糖尿病大鼠的机械痛行为具有抑制作用。实 验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972的 小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性（NCsi)对照组。其中\〈0.05， wp〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0012] 图2为2型糖尿病大鼠制模过程中的热缩足反射阈值变化图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后对2型糖尿病大鼠的热敏痛行为具有抑制作用。其中 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中\〈0.05， wp〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0013]图3为2型糖尿病大鼠制模过程中的尾神经感觉传导速度变化图。长非编码核糖 核酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可改善2型糖尿病大鼠的尾神经感觉传导速度。 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中\〈0.05， wp〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0014] 图4为2型糖尿病大鼠背根神经节（DRG)长非编码核糖核酸N0NRATT021972的逆 转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)检测结果图。长非编码核糖核酸N0NRATT021972的小干扰 RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上调的长非编码核糖核酸N0NRATT021972水平。实 验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972的 小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。图4 (a)为RT-PCR实 验结果图，图4(b)为实验数据分析比较柱状图，其中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01 表示与糖尿病模型组比较。
[0015] 图5为2型糖尿病大鼠DRG的？2&受体RT-PCR检测结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上调的？2乂3受体水平。实 验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972的 小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。图5 (a)为RT-PCR实 验结果图，图5(b)为实验数据分析比较柱状图，其中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01 表示与糖尿病模型组比较。
[0016] 图6为2型糖尿病大鼠DRG的？2&受体免疫组织化学检测结果图。长非编码核糖 核酸N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上调的P2X3受体水平。 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。图6 (a)为免疫组 织化学实验结果图，图6 (b)为实验数据分析比较柱状图，其中#p〈0. 01表示和正常组比较， ##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0017] 图7为2型糖尿病大鼠DRG的P2X3受体蛋白印迹检测结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠DRG上调的？2乂3受体水平。实 验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972的 小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。图7 (a)为蛋白印迹实 验结果图，图7(b)为实验数据分析比较柱状图，其中#p〈0. 01表示和正常组比较，##p〈0. 01 表示与糖尿病模型组比较。
[0018] 图8为2型糖尿病大鼠血清TNF-α变化检测结果图。长非编码核糖核酸 N0NRATT021972的小干扰RNA处理后可降低2型糖尿病大鼠上调的血清TNF- a变化水平。 实验分组：对照组；2型糖尿病模型组；2型糖尿病模型+长非编码核糖核酸N0NRATT021972 的小干扰RNA处理组；2型糖尿病模型+乱序的小干扰RNA阴性对照组。其中wp〈0. 01表 示和正常组比较，##p〈0. 01表示与糖尿病模型组比较。
[0019] 图9为2型糖尿病大鼠血清过氧化氢酶活性测定