Aldh2基因在制备预防苯乙烯致遗传毒性药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因的功能和应用领域，涉及到ALDH2基因在制备预防苯乙烯致遗传毒性药物中的应用。
【背景技术】
[0002]苯乙烯是一种重要的工业原料，被广泛应用于塑料、玻璃纤维、管道、汽车船体配件以及食品包装盒等生产。不仅生产车间的职业工人可能暴露于高浓度的苯乙烯，平常百姓也可能通过吸烟、汽车尾气、地毯和食品包装盒等暴露于苯乙烯。因此，苯乙烯对人体健康是否有不良的影响，尤其，其致癌性更是受到广泛的关注。
[0003]之前研究有证据表明苯乙烯在小鼠实验具有明确的致癌性，但在人群流行病调查结果并不一致。在苯乙烯遗传毒性的研究中，进一步发现苯乙烯确实能够引起机体的DNA损伤，而且这中损伤在不同的人群中有所差异，例如，在欧美白人当中，需要暴露于相对较高浓度的苯乙稀才能引起遗传损伤，而在东亚的黄色人群里，只需暴露于相对较低的苯乙烯浓度，就能够造成显著性的遗传损伤。
[0004]然而苯乙烯导致遗传损伤的人种差异性的原因到目前为止，并不清楚。一个最有可能的设想原因是人种遗传背景的差异性，但是还没有明确那些基因能够造成这种苯乙烯引起的遗传损伤人种差异性。结合之前的研究提示，苯乙烯经过体内酶代谢之后，其中间产物的毒性可能更大，如苯乙烯7，8-环氧化物。因此本研究的重点放在与苯乙烯相关的代谢酶上，尤其是乙醛脱氢酶(ALDH2)基因是否对苯乙烯致遗传毒性有影响的研究到目前为止还没有相关的报道。
【发明内容】
[0005]为解决现有职业病防治的技术缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种ALDH2在制备预防苯乙烯致遗传毒性的保健品或者药品中的应用。关于人ALDH2基因序列和相关信息可以参考此链接(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gene/217).本发明的目的通过以下技术方案实现:
本项发明以Aldh2基因敲除型(knockout, K0)和野生型(wild type, WT)小鼠作为模型，两种类型的小鼠吸入性暴露于苯乙烯后，检测苯乙烯在小鼠中的最终代谢产物苯乙醇酸(mandelic acid, MA)、苯乙酸酸(phenyl glyoxylic acid, PGA)的浓度，为了提高测量遗传毒性的可靠性和准确性，用多个遗传毒性的生物学指标，DNA基础损伤(TailIntensity)，氧化损伤(Net hOGGl DNA damage)和8-轻脱氧鸟苷(8-OH-dG)量化苯乙稀导致的遗传毒性，进一步分析ALDH2基因在苯乙烯致遗传毒性中的功能和应用，为研究预防苯乙烯致癌性提供了科学的理论依据和实验基础。
[0006]本发明的研究成果表明，相对于WT型，K0型小鼠的尿中代谢产物MA和PGA浓度明显降低，而在遗传损伤方面，苯乙烯在K0型小鼠中引起的遗传毒性也显著高于WT型。这提示ALDH2基因在苯乙烯致遗传毒性中具有调节作用，可能通过ALDH2加强苯乙烯在人体内的代谢，达到人体DNA免受或者少受苯乙烯及其中间代谢产物的攻击，最终实现ALDH2的保护作用。
[0007]本发明的优点在于:本项研究首次发现了 ALDH2基因可以缓解苯乙烯引起的遗传毒性，这对今后开发和制备预防苯乙烯致遗传毒性药物提供了重要的实验基础和科学依据。
【附图说明】
[0008]图1是小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，尿中代谢产物MA+PGA浓度在K0型和WT型的比较。从图中可以明显看出，暴露于100和200ppm的苯乙烯，无论是雄性小鼠还是雌性小鼠，K0型的尿中MA+PGA的浓度都显著低于WT型。
[0009]图2是雌雄小鼠，包括K0型和WT型，暴露于不同浓度的苯乙烯后，尿中8-0H-dG浓度。如图所示，在WT型小鼠中，无论是雄性(A图)还是雌性(C图)，暴露于多lOOppm，能显著性地提高尿中8-OH-dG浓度；而在K0型小鼠中，包括双性(B图和D图)暴露于20ppm的苯乙烯，就能够引起尿中8-OH-dG的显著提升。
[0010]图3-1为不同雄性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，血中白细胞的DNA基础损伤值和氧化损伤值，图3-2为不同雌性小鼠暴露于不同浓度的苯乙稀，血中白细胞的DNA基础损伤值和氧化损伤值，整体上，暴露浓度多lOOppm，苯乙烯能显著性地导致白细胞DNA基础损伤值和氧化损伤值增加，除了 WT型的雄性小鼠(E图)在暴露于lOOppm下，与对照组比，DNA氧化损伤有增加，但显著性只能达到边缘界。相对于WT型，K0型小鼠在暴露于20ppm下，2个遗传损伤指标值基本上都能够引起显著性增加，只有雄性小鼠(B图)的DNA基础损伤增加的显著性处于边缘界。
[0011]图4-1是不同雄性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，肝细胞的DNA损伤值。图4-2是不同雌性小鼠暴露于不同浓度的苯乙烯，肝细胞的DNA损伤值。与图3相比，图4的遗传毒性指标，除了肝细胞的DNA基础损伤和氧化损伤之外，多测量了一个肝脏组织的8-OH-dG。总的来说，肝细胞的DNA损伤结果基本和血中白细胞类似。
【具体实施方式】
[0012]下面对本发明的过程作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0013]动物实验:
实验动物种属，性别，年龄及来源:实验对象为C57BL/6J背景的小鼠，包括雄性和雌性，8周龄，体重在19-24g之间。Aldh2基因敲除型和野生型小鼠均由日本独立行政法人劳动安全卫生综合研究所友好提供。
[0014]K0型和WT型的雌雄小鼠按照6只/组划分。吸入性暴露实验在特定的不锈钢笼子中进行，苯乙烯的暴露浓度为0、20、100、200ppm。暴露过程中，苯乙烯浓度用气相色谱监测(ShimadzuGC_7A，Kyoto, Japan)。对照组暴露于经过过滤的空气。小鼠每天暴露时间为6小时，连续暴露5天/周，一共暴露6周。在暴露第5周最后的一天后，小鼠的24小时尿液被收集存放在-80 °C冰箱用于后续的分析。当最后的暴露结束后8小时，小鼠在麻醉的状态下被解剖，肝脏和血样被收集用于后续的分析。
[0015]碱性彗星实验法 5微升的新鲜全血与200微升lwt.%的低熔点胶(Sigma)在38°C均匀混合后，立即取30微升的混合液放置到已经打好孔的玻片上。玻片在_4°C冰箱平放15分钟后，立即用冷的溶解液(2.5 M NaCl, 100 mM Tris buVer, lOwt.%DMS0, lwt.% Triton X-100 ；pH 10)在黑暗中处理一个小时。然后玻片在裂解液(ImM EDTA, 300mM NaOH; pH>13)中裂解20分钟后，再放置电泳仪(25V，300mA)中电泳20分钟后，用中性缓冲溶液(0.4 M Trizmabase ;pH=7.5)中和5_10分钟后，再用酒精脱水10分钟。玻片上的每个孔用50微升的SYBRGreen 1 染色，每个样本通过Comet Assay IV capture system (Perceptive Instruments,Suffolk, UK)计数100至110个细胞。
[0016]取