稳定的人免疫缺陷病毒(HIV)包膜(EnV)三聚体疫苗及其使用方法
【专利说明】稳定的人免疫缺陷病毒（HIV)包膜（EnV)三聚体疫苗及其 使用方法
[0001] 关于联邦资助研究的声明 本发明在由国立卫生研究院（NationalInstitutesofHealth(NIH))/国家过 敏和感染性疾病研究院（NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases (NIAID))所授予的基金号AI096040和AI084794的政府支持下进行。政府享有本发明的某 些权利。
[0002] 发明背景 引出对抗病毒的细胞免疫应答的疫苗试图反映全球病毒的多样性以有效治疗或预防 病毒感染。对于HIV疫苗，稳固及各种各样的人免疫缺陷病毒（HIV)-特异性T细胞应答的 引发是有效的HIV疫苗所需要的。高度可变的包膜蛋白（Env)是对抗HIV的中和抗体的主 要目标，且可根据引出这些抗体应答来配合制备疫苗抗原。为此，积极寻求模拟天然HIV病 毒体上的Env的三聚体结构的免疫原作为基于抗体的HIV疫苗。然而，已证明难以产生引 出各种各样的中和抗体应答的生物化学上稳定的三聚体的Env免疫原。
[0003]因此，本领域中存在对于开发疫苗的未得到满足的需求，所述疫苗包括新颖的、优 化的三聚体的Env免疫原，所述三聚体的Env免疫原可广泛引出中和抗体应答以允许更成 功的HIV接种结果。
[0004] 发明概述 在第一方面，本发明以具有三个gpl40多肽的稳定的三聚体为特征，其中至少一个（如 两个或每个）gpl40多肽包括与SEQIDNO: 2 (mEnv+)具有至少90%同一性（如至少91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDN0: 2 (mEnv+)的序列的氨基酸序列。
[0005] 在相关的第二方面，本发明以具有三个gpl40多肽的稳定的三聚体为特征，其中 至少一个（如两个或每个）gpl40多肽包括基本上具有SEQIDNO: 1 (mEnv)或SEQIDN0: 3 (cEnv)的序列（如99%或更多同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 1 (mEnv) 或SEQIDNO: 3 (cEnv)的序列的氨基酸序列。
[0006] 在一些实施方案中，所述稳定的三聚体是异源三聚体。所述稳定的多肽异源三聚 体可包括两个嵌合Envlgpl40多肽（如mEnv和/或mEnv+)，其各自包括与SEQIDNO: 1 或 2具有至少 90% 同一性（如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的 氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 1或2的序列的氨基酸序列，及一个分化体（clade)C Envgpl40 多肽（如具有SEQIDNO: 3 的 "cEnv"），其包括与SEQIDNO: 3 (cEnv)具有 至少90%同一性（如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸 序列，或包括具有SEQIDNO: 3 (cEnv)的序列的氨基酸序列（如两个mEnv和一个cEnv; 两个mEnv+和一个cEnv;或一个mEnv、一个mEnv+、和一个cEnv)。在其它实施方案中，所 述稳定的异源三聚体可包括一个嵌合Envlgpl40多肽（如mEnv和/或mEnv+)，其包括与 SEQIDNO: 1 或 2 具有至少 90% 同一性（如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQIDNO: 1或2的序列的氨基酸序列，及两个分 化体CEnvgpl40多肽（如cEnv)，其各自包括与SEQIDNO: 3具有至少90%同一性（如 至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有SEQ IDNO: 3的序列的氨基酸序列（如一个mEnv和两个cEnv;-个mEnv+和两个cEnv)。在一 些实施方案中，稳定的异源三聚体包括两种不同的嵌合Envl序列的组合（如一个mEnv和 两个mEnv+ ;两个mEnv和一个mEnv+ ;或一个mEnv、一个mEnv+、和cEnv)。在一些实施方案 中，稳定的异源三聚体包括cEnv和相同的Envl多肽中的两个（如两个mEnv和一个cEnv; 两个mEnv+和一个cEnv)。在其它实施方案中，稳定的异源三聚体包括一个cEnv和两个不 同的嵌合Envl多肽（如一个cEnv、一个mEnv，和一个mEnv+)。在其它实施方案中，稳定的 异源三聚体包括两个cEnv多肽和一个嵌合Envl多肽（如两个cEnv和一个mEnv、或两个 cEnv和一个mEnv+)。
[0007] 或者，可制备稳定的gpl40Env三聚体，其中三聚体中的一个或两个gpl40Env多 肽中具有SEQIDNO: 4的序列（嵌合gpl40Env2，"mEnv2"）或SEQIDNO: 5的序列（嵌 合gpl40Env3，"mEnv3")。在另一实施方案中，所述稳定的三聚体具有三个gpl40多肽，其 中至少一个（如两个或每个）gpl40多肽包括与SEQIDN0: 4或5具有至少90%同一性 (如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或包括具有 SEQIDN0: 4或5的序列的氨基酸序列。优选地，以与修饰mEnv、mEnv+、或cEnv(其各自 拥有三聚化结构域）类似的方式来修饰mEnv2或mEnv3,如下文讨论。因此，在本发明的一 些实施方案中，可制备稳定的gpl40Env三聚体，其具有下列组成的多肽：一个mEnv和两个 mEnv2 ;两个mEnv和一个mEnv2 ;-个mEnv+ 和两个mEnv2 ;两个mEnv+ 和一个mEnv2 ; - 个cEnv和两个mEnv2 ;两个cEnv和一个mEnv2 ; -个mEnv、一个mEnv+、和一个mEnv2 ; 一个mEnv、一个cEnv、和mEnv2 ; -个mEnv+、一个cEnv、和一个mEnv2 ; -个mEnv和两个 mEnv3 ;两个mEnv和一个mEnv3 ; -个mEnv+ 和两个mEnv3 ;两个mEnv+ 和一个mEnv3 ; 一个cEnv和两个mEnv3 ;两个cEnv和一个mEnv3 ; -个mEnv、一个mEnv+、和一个mEnv3 ; 一个mEnv、一个cEnv和mEnv3 ; -个mEnv+、一个cEnv、和一个mEnv3 ; -个mEnv、一个 mEnv2、和一个mEnv3 ; -个mEnv+、一个mEnv2、和一个mEnv3 ;或一个cEnv、一个mEnv2、和 一个mEnv3〇
[0008] 在第三方面，本发明以包括第一或第二方面的稳定的三聚体的组合物为特征。在 实施方案中，第三方面的组合物包括一种或更多种不同的稳定的三聚体。在其它实施方案 中，所述不同的稳定的三聚体（一种或更多种）具有三个gpl40多肽，其中至少一个（如 两个或每个）gpl40多肽包含与SEQIDN0: 1、2、3、4或5具有至少90%同一性（如至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一1性）的氨基酸序列，或包含具有SEQID NO: 1、2、3、4或5的序列的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述不同的稳定的三聚体（一 种或更多种）可为同三聚体或异源三聚体。在一些实施方案中，第三方面的组合物进一步 包括药学上可接受的载体、赋形剂、或稀释剂、和/或佐剂。
[0009] 在第四方面，本发明以包括第三方面的任一种组合物的疫苗为特征。在一些实施 方案中，疫苗用于治疗有需要的对象中人免疫缺陷病毒（HIV)感染或降低其免疫缺陷病毒 (HIV)感染风险。在一些实施方案中，在给药至对象之后，疫苗引出中和抗-HIV抗血清（如 中和抗-HIV-1抗血清）的产生。抗-HIV抗血清可中和例如选自分化体A、分化体B、和分 化体C的任一种或更多种的HIV(如HIV-1)。. 在第五方面，本发明以具有编码至少一种（如两种、或三种或更多种）gpl40多肽的核 苷酸序列的核酸分子为特征，其中至少一种gpl40多肽包括：（a)与SEQIDNO: 1具有至 少95%同一性（如至少96%、97%、98%、或99%同一性）的氨基酸序列，或具有SEQIDN0:1 的序列的氨基酸序列；（b)与SEQIDNO: 2具有至少95%同一性（如至少96%、97%、98%、 或99%同一性）的氨基酸序列，或具有SEQIDNO: 2的序列的氨基酸序列；或（c)具有SEQ IDNO: 3的序列的氨基酸序列；⑷具有SEQIDNO: 4的序列的氨基酸序列；（e)具有SEQ IDNO: 5的序列的氨基酸序列或它们的组合物。在一些实施方案中，核酸分子进一步包括 核苷酸序列，其编码一种或更多种不同的（如第二、第三、或第四）gpl40多肽（如与SEQID NO: 1、2、3、4和/或5具有至少95%同一性（如至少96%、97%、98%、或99%同一性），或具 有SEQIDNO: 1、2、3、4和/或5的序列的gpl40多肽）。在一些实施方案中，核酸分子包 括一个或更多个内部核糖体进入位点（IRES)序列以允许来自单核酸分子转录物的多重肽 (multiplepeptide)或多肽链的表达。
[0010] 在第六方面，本发明以包括第五方面的一种或更多种核酸分子的载体为特征。在 一些实施方案中，所述载体为腺病毒载体或痘病毒载体。腺病毒载体可来源于，例如，重组 腺病毒血清型11 (Adll)、腺病毒血清型15(Adl5)、腺病毒血清型24(Ad24)、腺病毒血清型 26 (Ad26)、腺病毒血清型34 (Ad34)、腺病毒血清型35 (Ad35)、腺病毒血清型48 (Ad48)、腺病 毒血清型49 (Ad49)、腺病毒血清型50 (Ad50)、Pan9 (AdC68)、或其嵌合变体（如腺病毒血清 型5HVR48(Ad5HVR48))。痘病毒载体可源于，例如，修饰的安卡拉痘苗病毒（MVA)。 在第七方面，本发明提供治疗有需要的对象中HIV感染或降低其HIV感染风险的方法， 所述方法通过向对象（例如哺乳动物，例如，人）施用治疗有效量的本发明的组合物（如第 一或第二方面的任一种稳定的三聚体、第三方面的组合物、第四方面的疫苗、第五方面的核 酸分子、和/或第六方面的载体）。根据本发明的该第七方面，治疗可为治疗性的或预防性 的。
[0011] 在第八方面，本发明提供减少感染HIV的对象中HIV介导的活动的方法，所述方法 通过向对象施用治疗有效量的本发明的组合物（如第一或第二方面的任一种稳定的三聚 体、第三方面的组合物、第四方面的疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的载体）。 在一些实施方案中，HIV介导的活动为病毒传播、感染、或细胞融合。细胞融合可为，例如， 靶细胞进入或合胞体形成。在一些实施方案中，与治疗之前的对象的HIV滴度或感染HIV 但未用本发明组合物（一种或更多种）治疗的对照对象的HIV滴度相比，在向对象（例如 哺乳动物，例如，人）施用疫苗之后，感染HIV的对象中的HIV滴度减小（如至少约5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多。
[0012] 在一些实施方案中，经下列途径施用所述组合物（如疫苗）：肌内、静脉内、皮 内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体 内、阴道内、直肠内、外用（topically)、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内 (intraumbilically)、眼内、口服、外用（topically)、局部（locally)、通过吸入、通过注 射、通过灌输、通过持续灌输、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、通过管 饲法、以乳霜或以脂质组合物。在一些实施方案中，向对象施用至少一剂量（如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、或更多剂量）的组合物或每天、每周、每月、或每年向对象施用至少一剂量（如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多剂量）。可限定施用周期（如1-4周、1-12个月、1-20年） 或可持续对象的一生。在其它实施方案中，向对象施用至少两剂量（如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、或更多剂量）的组合物。在又一实施方案中，将组合物作为基础免疫（prime)组合物或 加强免疫（boost)组合物或以基础-加强免疫（prime-boost)方案向所述对象施用。在优 选的实施方案中，将本发明的一种或更多种组合物（如疫苗）作为加强免疫施用。
[0013] 在另一优选的实施方案中，本发明以治疗对象中HIV感染或降低其HIV感染风险 的方法为特征，所述方法通过以基础-加强免疫接种方案中的基础免疫组合物施用疫苗， 所述疫苗包括第一多肽，所述第一多肽与SEQIDN0: 6具有至少85%氨基酸序列同一性 (如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同 一1性），或具有 SEQIDN0: 6的序列，或包括至少一种包括编码该第一多肽的第一核酸分子的第一载体 (如腺病毒或痘病毒载体）。任选地，也可将第二多肽与第一多肽组合施用，所述第二多肽 与SEQIDN0: 7 具有至少 85% 同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、或99%同一性），或具有SEQIDN0:7的序列，或，若施用编码第一多肽的第 一载体，则可将包括编码第二多肽的第二核酸分子的第二载体（如腺病毒或痘病毒载体） 与第一载体组合施用。基础-加强免疫方案中的加强免疫组合物可包括一种或更多种本发 明的组合物（如第一或第二方面的任一种稳定的三聚体、第三方面的组合物、第四方面的 疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面的载体）。在另一实施方案中，基础 -加强免疫 方案中的基础免疫组合物可包括具有SEQIDN0: 8-32中任一种序列（一种或更多种）的 多肽（一种或更多种），或一种或更多种包括编码SEQIDN0: 8-32中任一种的核酸分子的 载体，然后包括一种或更多种本发明的组合物的加强免疫（如第一或第二方面的任一种稳 定的三聚体、第三方面的组合物、第四方面的疫苗、第五方面的核酸分子、和/或第六方面 的载体）。
[0014] 在其它实施方案中，一种或更多种本发明的组合物（如疫苗）作为基础-加强免 疫方案中的基础免疫组合物施用且加强免疫组合物是不同的疫苗组合物，如包括以下的疫 苗：一种或更多种多肽，所述多肽与任一种或更多种SEQIDN0: 6-32的序列具有至少85% 氨基酸序列同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或 99% 同一性），或具有任一种或更多种SEQIDNO: 6-32(优选SEQIDN0: 6和/或7的多肽）， 或包括一种或更多种载体（如腺病毒或痘病毒载体），所述载体各自包括编码一种或更多 种多肽的核酸分子，所述多肽与一种或更多种SEQIDN0: 8-32具有至少85%同一性（如 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性），或具有一种 或更多种SEQIDN0: 8-32的序列（优选编码SEQIDN0: 6和/或7的多肽的载体）。
[0015] 在一些实施方案中，例如，可向对象以非载体组合物施用本发明的多肽组合物 (如本发明的稳定的gpl40Env三聚体）。施用的多肽组合物可包括介于约1Pg和1mg 之间的稳定的Env三聚体，并更优选包括介于50Pg和300Pg之间的本发明的稳定的Env 三聚体。
[0016] 在输送载体为病毒的其它实施方案中，可向对象施用至少约lxlO3病毒颗粒（vp)/ 剂量或介于ΙχΙΟ1和1x10 14vp/剂量之间、优选介于lxl〇3和1x10 12vp/剂量之间、并更优 选介于lxlO5和lxlO11vp/剂量之间。可在暴露前或诊断前例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 15、20、30、35、40、45、50、55、或60分钟，2、4、6、10、15、或24小时，2、3、5、或7天，2、4、6或 8周，或甚至3、4、或6个月施用所述组合物，或可在HIV诊断后或暴露于HIV后15-30分钟 或 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、20、24、48、或 72 小时，2、3、5、或 7 天，2、4、6 或 8 周，3、4、6、 或9个月，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长时间向对象施用。每天、每周、每月或每 年向所述对象施用一次一或更多剂量的组合物。当治疗HIV感染时，可在HIV感染或疾病 /综合征（如获得性免疫缺陷综合征（AIDS))的症状出现或确诊之前，或在诊断或症状变 得明显之后向对象施用本发明的组合物（一种或更多种）（如第一、第二、或第三方面的任 一种稳定的三聚体、第四或第五方面的组合物、第六方面的疫苗、第七方面的核酸分子、和/ 或第八方面的载体）。可在例如，症状的诊断或临床识别之后立即施用所述组合物（一种或 更多种）或在症状的诊断或检测后2、4、6、10、15、或24小时，2、3、5、或7天，2、4、6或8周， 或甚至3、4、或6个月施用所述组合物（一种或更多种）。
[0017] 在第九方面，本发明提供用于治疗有需要的对象中HIV感染或降低其HIV感染风 险的疫苗的制备方法。所述方法包括以下步骤：(a)将本发明第二方面的核酸（如进一步包 括第八方面的载体的核酸）与细胞接触；及（b)使核酸在细胞中表达以形成稳定的三聚体。 在一些实施方案中，所述方法经体外或离体（exw>o)实施。在一些实施方案中，所述细胞 是细菌、植物或哺乳动物的细胞（如人或非人哺乳动物的细胞）。在优选的实施方案中，所 述哺乳动物的细胞是293T细胞。
[0018] 在最后的方面，本发明以试剂盒为特征，所述试剂盒包括：(a)本发明的组合物 (如第一、第二、或第三方面的任一种稳定的三聚体、第四或第五方面的组合物、第六方面的 疫苗、第七方面的核酸分子、和/或第八方面的载体，如包括mEnv和/或mEnv+三聚体和 cEnv三聚体的疫苗）；(b)药学上可接受的载体、赋形剂、或稀释剂；及（c)其使用说明。所 述试剂盒可任选地包括佐剂。
[0019] 在本发明所有方面的优选的实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选灵长类，例如人。
[0020] 定义 在此使用的术语"约"表示所列举值的+/- 10%。
[0021] "腺病毒"表示中等尺寸的（90-100nm)、非包膜的二十面体病毒，其包括衣壳和双 链线型DNA基因组。所述腺病毒可为天然存在的、但孤立的腺病毒（如sAd4287、sAd4310A、 或sAd4312)或为重组腺病毒（如复制缺陷型或有复制能力的sAd4287、sAd4310A、或 sAd4312、或它们的嵌合变体）。
[0022] 在此使用的"施用"表示向对象给予一定剂量的药物组合物（如本发明的组合物， 例如第一或第四方面的任一种疫苗、第三方面的组合物、第五方面的核酸分子、和/或第六 方面的载体）的方法。可经下列途径施用在此描述的方法中使用的组合物，例如，肌内、静 脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、 玻璃体内、阴道内、直肠内、外用、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、 口服、外用、局部、通过吸入、通过注射、通过灌输、通过持续灌输、通过局部灌注直接浸浴靶 细胞、通过导管、通过灌洗、通过管饲法、以乳霜或以脂质组合物。优选的施用方法可取决于 各种因素（如施用组合物的组分和欲治疗的病情的严重性）而改变。
[0023] 在此使用的术语"分化体"是指根据它们的遗传相似性分类的相关人免疫缺陷病 毒（HIV)。目前存在三组HIV-1分离株：M、N和0。Μ组（主株）由至少十个分化体，A到J 构成。0组（外围株）可由相似数目的分化体构成。N组是既未被分类至Μ组又未被分类至 0组的新的HIV-ι分离株。在某些示例性的实施方案中，在此描述的本发明的组合物（如 第一或第四方面的任一种疫苗、第三方面的组合物、第五方面的核酸分子、和/或第六方面 的载体）将识别并引起对抗二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多个分化体和/或两组或更 多组HIV的免疫应答（如中和抗-HIV抗血清）。
[0024] 贯穿本说明书和权利要求，将理解词语"包含（comprise)"，或变型例如"包括 (comprises) "或"含有（comprising,) "意味着包括所述整数或整数组但不排除任何其它 整数或整数组。
[0025] 在此使用的术语"包膜糖蛋白"是指，但不限于，在HIV病毒体的包膜表面和感染 HIV的细胞的质膜表面上表达的糖蛋白。办κ基因编码gpl60,所述gpl60经蛋白水解裂解 成gpl20和gp41包膜（Env)蛋白。Gpl20在具有⑶4受体的靶细胞（例如，如T-辅助细 胞）上结合此类受体。Gp41以非共价方式结合gpl20,并提供第二个步骤，通过所述步骤 HIV进入细胞。gp41原本掩埋在病毒包膜内，但是当gpl20结合⑶4受体，gpl20改变自身 构型导致gp41被暴露，在此它可协助与宿主细胞的融合。
[0026] "基因产物"表示包括自基因转录的mRNA，及自那些mRNA翻译的多肽。
[0027] "异源核酸分子"或"异源基因"表示可被插入本发明的载体（如腺病毒或痘病毒 载体）中的任何外源核酸分子（如编码本发明的优化的gpl40Env多肽的核酸分子），用 于转移至细胞、组织、或有机体，用于由异源核酸分子或基因编码的感兴趣的基因产物或其 片段的后续表达。在优选的实施方案中，可向作为本发明一部分的细胞或对象施用的异源 核酸分子可包括，但不限于，编码至少一种优化的嵌合Env多肽（如嵌合Envl多肽，例如 mEnv和mEnv+)和/或分化体CEnv多肽（如分化体CEnvl多肽，例如cEnv)的核酸分子。
[0028] "人免疫缺陷病毒"或"HIV"表示慢病毒属的病毒，其为逆转录病 毒汉e&oKirii/ad家族的一部分，并包括，但不限于，HIV-1型（HIV-1)和HIV-2型（HIV-2) 两种感染人类的HIV。
[0029] "免疫应答"表示对象（如人）的免疫系统对于抗原或抗原决定簇的任何应答。示 例性的免疫应答包括体液免疫应答（如抗原特异性抗体，如中和抗体（NAb)的产生）和细 胞介导的免疫应答（如淋巴细胞增殖）。
[0030] 在此使用的关于HIV的术语"减少"是指HIV介导的活动（如感染、融合（如靶细胞 进入和/或合胞体形成）、病毒传播等）的减少或降低和/或病毒效价的降低。与对照对象 (如未经治疗的对象或采用安慰剂治疗的对象）相比，HIV介导的活动和/或HIV滴度可降 低 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 1%、99. 2%、 99. 3%、99. 4%、99. 5%、99. 6%、99. 7%、99. 8%、99. 9% 或更多。
[0031] "中和