[0215]综上所述，与野生型ifreGyrA(SEQIDN0: 17)和最小化[106(GS)4161]_ifre GyrA(SEQIDNO: 19)内含肽相比，[Cys3,106 (GS) 4161]-ifreGyrA内含肽（SEQIDNO: 20) -般导致水解降低和融合蛋白表达水平的相伴的提高。
[0216]表 4.天然ifreGyrA、[106(GS)4161]_ifreGyrA和[Cys3,106(GS)4161]_ifreGyrA 内含肽的融合蛋白的水解水平、表达水平和溶解度。
[0217] 实施例3.伸用工稈改诰的内含肽的肽α-硫醅形成 为了检查工程改造的[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA内含肽对靶肽的产量的作用，从 分别含有天然ifreGyrA(SEQIDN0: 17)、[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA(SEQIDN0: 20)和[Cys3]-ifreGyrA(SEQIDNO: 18)的融合蛋白1A、1C和ID中分离氨基端带标签的 [Gly4]-APYY(4-36)α-硫酯。
[0218] 如通用方法所述，使融合蛋白1A、1C和ID在含有200mLLB培养基的摇瓶中表达。 如通用方法所述进行SDS-PAGE分析，表明>90%的融合蛋白在不溶性部分中。在25mM磷 酸钠pH5缓冲液中通过超声裂解收获的细胞，将不溶性部分在洗涤缓冲液[25mM磷酸钠， 11111^0了六，1%1^切11乂-100，？!17]中洗涤两次，接着在100 1111磷酸钠？!17.5缓冲液中洗 涤一次。将分离的包含体在增溶缓冲液[100mM磷酸钠，8Μ脲，1mMTCEP，1mMEDTA，pH 7. 5] (20mL)中重新悬浮，并在轻轻搅拌下在5°C下孵育2小时。表达产量通过RP-UPLC 方法A估算。样品经过滤（0. 45μm)，通过快速稀释入9体积的冷的重折叠缓冲液[100 mM磷酸钠，1.3Μ脲，150mMNaCl，lmMEDTA，1mMTCEP，pH7.5]中重折叠，产生 135mM NaCl和2M脲的浓度。紧接稀释之后，通过将MESNa加至100mM的终浓度，开始切割。使 反应在5°C、pH7. 3下进行20小时。通过RP-UPLC方法B和LC-MS方法A监测硫醇基诱导 的切割。融合蛋白及其相应的内含肽的观测质量与预期相关（表3)。
[0219] 硫醇基诱导的反应混合物通过3体积的缓冲液A[50mM磷酸钠，1mMEDTA，pH7] 稀释以降低电导率至约12mS/cm，随后采用AKTAexplorer100系统（GEHealthcare)，以 5mL/ 分钟加载到HiTrapSPSepharoseHP(16X25mm，5mL,GEHealthcare)柱中。柱 用9柱体积的缓冲液A洗涤，使用超过20柱体积的含有1MNaCl的0-100%缓冲液A线性 梯度以3mL/分钟洗脱氨基端带标签的[Gly4]-APYY(4-36)α-硫酯。合并含有α-硫酯 的部分，通过RP-UPLC方法C对量进行估算。产物的特性通过ESI-MS确认，得到12315. 35 Da的去卷积质量（deconvolutedmass)(预期：12315. 09)。产量列于表5。
[0220] 表5.使用不同的内含肽变体的，带标签的[Gly4]-APYY(4_36)α-硫酯的纯化 a
[0221] 综上所述，获自含有野生型ifreGyrA内含肽（SEQIDNO: 14)的蛋白质1A的 氨基端带标签的[Gly4]-APYY(4-36)α-硫酯的产量与含有[Cys3]-ifreGyrA(SEQID NO: 18)的蛋白质ID的产量类似，这表明T3C突变本身不增加靶肽的量（表5)。然而，当 从含有[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA内含肽（SEQIDN0: 20)的蛋白质1C中分离时， 与蛋白质1A相比，产量增加约80%，表明了包含大小被减到最小和T3C突变的工程改造的 内含肽正向地影响靶肽产量。重要的是，与1A相比，蛋白质1C和1D的氨基端带标签的 [Gly4]-APYY(4-36)α-酸副产物的量降低，表明了T3C突变在纯化期间也有有益作用。
[0222] [Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA内含肽（SEQIDΝ0: 20)内含肽提高融合蛋白的 表达水平，并增加靶肽的产量。由于这对于[Cys3]-ifreGyrA内含肽（SEQIDN0: 18)而 目未观察到，所以大小被减到最小有助于这些提尚的性质。
[0223]实施例4.伸用「Cvs3,106(GS)彡611-#xeGvrA内含肽的α-酰胺化肽的产牛 用于大规模生产α-酰胺化肽的包含工程改造的内含肽的融合蛋白的潜在应用取决 于其在高细胞密度条件下表达的能力。对于在生物反应器中分批补料发酵后从蛋白质1C 中分离的[Gly4]-APYY(4-36) -NH2而言，这一点被证实。
[0224]4. 1.融合蛋白1C的分批补料发酵 使含有质粒/dC的BL21 (DE3)细胞的预先培养物在摇瓶中在补充100μg/mL氨苄西林 的LB培养基中生长6-8小时。在需氧条件下在500mL生物反应器（DasGibTechnology) 中用最初体积为200mL的成分确定的发酵培养基的进行发酵，所述成分确定的发酵培养基 含有葡萄糖和氨分别作为碳源和氮源，并在灭菌（在121°C下高压灭菌30分钟）后加入100 μg/mL氨苄西林。将预先培养物接种在生物反应器中以达到约0.2的起始0D6。。。通过加 入5ΝΝΗ40Η保持pH在7. 0下，保持温度在37 °C下，在整个发酵期内，让0. 4L/分钟的流 速的空气吹泡通过肉汤平培养基。控制振荡速度（400-1200rpm)以达到至少30% 02饱和 度的溶解氧水平。发酵培养基中的起始葡萄糖浓度为10g/L，从发酵5小时起，持续以逐步 递增的方式（inincreasingsteps)加入与镁和痕量金属一起供应的葡萄糖进料，直至10 g葡萄糖/L/小时的最终进给速率，该速率被保持直到发酵停止。在0D_ 50-60时通过加 入0. 5mMIPTG诱导融合蛋白的产生。在4小时诱导后停止发酵。在具有F10-6x500y转 子（13000X貧）的SorvallRC6Plus离心机中通过离心收获细胞，并保存在-20°C下。 使细胞在裂解缓冲液[25mM磷酸钠，pH5]中重新悬浮至40-50的0D6。。，并在4°C下搅拌 1小时。在持续细胞破坏系统E615中在1.36Kbar的压力下裂解细胞。将裂解的细胞离 心下来，倾析上清液。让不溶性包含体在洗涤缓冲液[25mM磷酸钠，pH7, 5mMEDTA，1% TritonX-100]中洗涤，在5°C下搅拌2小时，接着在MilliQ水中洗涤一次。将包含体等分 为20个较小的部分。
[0225]4. 2.「Glv4l-APYY(4-36)-酰胺（「Glv4l-APYY(4-36) -NH2)的分离 策略概述于图2。使来自1/20分批补料培养的包含体在变性缓冲液[25mM磷酸钠，8Μ脲，1mMTCEP，1mMEDTA，pH7. 5] (30mL)中重新悬浮，轻轻搅拌的同时在5°C下孵育 3.5小时。融合蛋白的产量通过RP-UPLC方法A估算，并用变性缓冲液将样品稀释至约1.2 mg/mL的浓度。通过在搅拌的同时在5分钟内将蛋白质加入8. 5体积的稀释缓冲液[25mM 磷酸钠，1mMTCEP，1mMEDTA，0. 5MNaCl，pH7. 5]中，使蛋白质重折叠。通过用在稀释 缓冲液中的2Μ原液将MESNa加至100禮，立即开始硫醇基诱导的切割。在搅拌的同时，使 反应在0. 8Μ脲和0. 5MNaCl溶液中在5°C和pH7. 3下过夜进行。
[0226] 通过加入固体順4!10)3至1Μ的终浓度，来进行酰胺化。用1NNaOH调节溶液的 pH至8. 5,使反应在5°C下过夜进行。通过LC-MS方法A监测硫醇基诱导的切割和酰胺化反 应（表6)。
[0227] 表6.在蛋白质1C的硫解作用和酰胺化后的质量
酰胺化混合物经过滤（〇. 22μπι)，滤器用8Μ脲洗涤。将脲洗涤物加载到Phenomenex Luna柱（15μπι和 300A; 10X250mm)中，接着酰胺化混合物使用AKTAExplorer100 (GEHealthcare)。使用 0· 1%TFA/ 水（溶剂A)和 0· 1%TFA/ 乙腈（溶剂B)以 25-45%B的线性梯度，洗脱氨基端带标签的[Gly4]-APYY(4-36)-NH2。在冻干后，将蛋白质溶于25mM 磷酸钠pH7. 5缓冲液中，使用特异性识别序列EVLFQ/GP的HRV14-3C蛋白酶，通过酶促切 割除去氨基端标签。使用1:12 (w/w)的酶与底物比率，允许在室温下孵育至少48小时。 在调节消化物的pH至4. 3后，通过以下回收[Gly4]-APYY(4-36)-NH2:以3mL/分钟加载到 用洗脱液A[10mMNH4HC03，pH5.5]平衡的预充填的HiTrapSPs印haroseHP柱（5mL) 中，接着超过5柱体积的0-100%洗脱液B[10mMNH4HC03,pH8. 5]的梯度，并使用等度洗 脱液B达 10CV，洗脱[Gly4]-APYY(4-36)-NH2。[Gly4]-APYY(4-36)-My^.性和纯度通过 RP-UPLC方法C测定，通过LC-MS方法B表征，同时通过化学发光氮检测估算产量（表7)。
[0228] [Gly4]-APYY(4-36) _順2以 99% 的纯度和 184mg/L的产量分离（表 7)。
[0229] 综上所述，含有[Cys3，106(GS)4161]_ifreGyrA(SEQIDN0: 20)的融合蛋白 1C 在高细胞密度条件下成功表达并转化成[Gly4]-APYY(4-36)-NH2，表明了工程改造的内含 肽用于大规模生产α-酰胺化肽的适用性。
[0230] 表7.从含有工程改造的内含肽的融合蛋白1C的分批补料培养生产α-酰胺化 [Gly4]-APYY(4-36)-NH23
虽然本文说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现将想到许多修 饰、取代、变化和等同内容。因此，要了解，随附权利要求书旨在涵盖落入本发明真实精神内 的所有这类的修饰和变化。
【主权项】
1. 一种用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其 中所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且 通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDN0:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。2. 权利要求1的方法，其中所述内含肽是GyrA内含肽。3. 权利要求2的方法，其中所述内含肽是ifreGyrA内含肽。4. 权利要求3的方法，其中所述内含肽是通过切除相当于ifreGyrA内含肽（SEQID NO: 1)的残基107-164的残基或相当于ifreGyrA内含肽（SEQIDNO: 1)的残基107-164 的残基的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被包含1-10个氨基酸的接头置换的 ifreGyrA内含肽。5. 权利要求4的方法，其中所述接头包含6-10个氨基酸，且其中接头的至少6个氨基 酸是甘氨酸和/或丝氨酸。6. 权利要求5的方法，其中所述内含肽的序列是SEQIDNO: 20。7. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述靶肽是α-酰胺化肽，例如PYY、PP、 a-CGRP、CT和胰岛淀粉样多肽或其类似物。8. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述融合蛋白还包含允许通过亲和色谱法或其 它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点，且其中所述蛋白酶位点允许所 述纯化标签的连接。9. 前述权利要求中任一项的方法，所述方法还包括的硫醇基诱导切割融合蛋白，产生 靶肽的α-硫酯。10. -种用于生产α-酰胺化肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表 达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和SEQIDNO: 20的内含肽。11. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物细胞或 在转基因哺乳动物的体液中表达。12. -种包含靶肽和内含肽的融合蛋白，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通 过与ifreGyrA内含肽（SEQIDNO: 1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。13. -种内含肽，其大小被减到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDNO: 1)的 3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。14. 权利要求13的内含肽，其中所述内含肽的序列是SEQIDNO: 20。15. -种DNA构建体，其编码权利要求12限定的融合蛋白。
【专利摘要】本发明提供通过重组手段生产肽的方法。肽作为包含靶肽和工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达。本发明还提供工程改造的内含肽、包含所述内含肽的融合蛋白和编码这些融合蛋白的DNA构建体。在硫醇基诱导切割融合蛋白时，得到靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端α-硫酯原则上可与任何亲核体反应，因此该策略允许更大范围的羧基端修饰例如化学连接、生物缀合或酰胺化。本发明的工程改造的内含肽在大小上被减到最小，并且通过与<i>Mxe</i>？GyrA内含肽(SEQ？ID？NO:1)的3位的比对在相应位置上具有半胱氨酸突变，导致融合蛋白的表达水平提高和分离靶肽的产量较高，因此使本发明的方法适于生产规模。
【IPC分类】A61K38/22, C12N15/62, C07K7/00, C07K14/575, C12N15/09
【公开号】CN105263509
【申请号】CN201480030331
【发明人】A.C.肖, J.C.诺里德, L.阿伯特森
【申请人】诺和诺德股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年5月28日
【公告号】EP3003357A1, US20160096872, WO2014191455A1