REG蛋白表达下调或上调是指CREG蛋白的表达水平与未经处理的细胞或组织相比，提高或降低至少25 %，例如至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90%、100%，或者提高大于100%。
[0025]在本发明的实施方案中，通过上调血管内CREG蛋白的表达水平，能够缩小动脉粥样硬化斑块面积，并减轻动脉粥样硬化引起的局部炎症反应。
[0026]在本发明的具体实施方案中，通过感染Ad293包装细胞，扩增获得高滴度的重组人CREG腺病毒；
[0027]在本发明的具体实施方案中，通过高脂喂养ApoE基因敲除小鼠制备动脉粥样硬化小鼠模型；
[0028]在本发明的具体实施方案中，通过尾静脉注射重组人CREG腺病毒，感染动脉粥样硬化小鼠；
[0029]在本发明的具体实施方案中，通过HE染色、油红染色、炎症指标检测等评价重组人CREG腺病毒抑制动脉粥样硬化的效果。
【附图说明】
[0030]图1.AdCREG 感染 Ad293 细胞 3 天(200 X)。
[0031]⑷光镜下Ad293形态。
[0032](B)荧光显微镜下同一视野绿色荧光表达。
[0033]图2.正常小鼠血管和apoE-/-敲除小鼠高脂喂养8周血管的主动脉HE染色(100X) ο
[0034]图3.尾静脉注射AdCREG感染高脂喂养ApoE-/-小鼠的主动脉感染效率及外源性CREG表达规律。A)主动脉GFP及CREG免疫荧光染色结果显示感染成功，且有外源性CREG表达(100X) ；B)感染后不同时间点GFP及CREG表达，柱形图显示Western Blot条带灰度值分析。以正常血管为参照，*p〈0.05，η = 5。
[0035]图4.AdCREG治疗小鼠动脉粥样硬化效果判定。A主动脉HE染色观察斑块形成，柱形图显示粥样硬化斑块占中膜面积的百分比；以高脂喂养8w血管为对照，*P〈0.05，n = 5 ;B主动脉油红染色观察粥样硬化斑块形成，柱形图显示粥样硬化斑块占血管面积的百分比；以高脂喂养8w血管为对照，*P〈0.05，η = 5 ；C ELISA检测主动脉TNF α表达水平；以高脂喂养8w血管为对照，*Ρ〈0.05, η = 5 ；D Western Blot检测NF_ κ B,柱形图显不WesternBlot条带灰度值分析；以高脂喂养8w血管为对照，*P〈0.05，η = 5 ；E Western Blot检测I κ B a，柱形图显示Western Blot条带灰度值分析，以高脂喂养8w血管为对照，*P〈0.05，η = 5。
【具体实施方式】
[0036]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0037]两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS17.0软件包处理。Ρ〈0.05为有统计学差异。
[0038]实施例1.重组人CREG腺病毒(AdCREG)的扩增及滴度测定
[0039]AdCREG于2008年1月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉，武汉大学)，名称为人腺病毒5型Ad5 — CREG，保藏号为CCTCC 一 V200801 (参见中国专利CN101475961A，发明名称:表达人CREG的重组腺病毒及其用途)。用含5%胎牛血清的DMEM培养5X106Ad293细胞(人胚肾细胞，购自美国Stratagene公司，货号#240085)。取0.5μ 1 AdCREG病毒保存液，加入含5 %胎牛血清的DMEM至1ml，混匀，得到病毒混合液。移去Ad293细胞的培养液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3次。置于37°C C02孵箱中孵育120min，加入9ml含5%胎牛血清的DMEM培养液，以总体积为10ml的培养液继续培养细胞。待大部分细胞变圆脱落后，收集全部细胞，600g离心5min沉淀细胞。用冰的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞，-80°C至37°C反复冻融3次。4°C 16000g离心lOmin，去除细胞碎片，收集上清。置于-80°C冰箱冻存备用。
[0040]使用前，通过50%组织培养感染剂量(TCID50)法测定病毒滴度。具体方法为收集一瓶Ad293细胞，计数。用含2%胎牛血清的DMEM重悬细胞，调整密度为105个细胞/ml，准备总体积为20ml的细胞悬液。用12道排枪在2块96孔板中每孔加入0.lml细胞悬液。准备稀释病毒液:第1管中加入0.9ml DMEM培养液，其余加入1.8ml，第1管中再加入0.lml病毒保存液，上下吸打5次混匀。换用新枪头，从第1管中吸取0.2ml加入第2管中，反复稀释至最高稀释度。用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.lml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。置37°CC02孵箱中培养10天。第10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现致细胞病变效应(CPE)的孔数，以Karbers公式计算病毒滴度。病毒滴度T = 101+d(s α5)，其中d = Log10病毒液稀释度，S = CPE孔总数/10。
[0041]实验结果显示，腺病毒感染Ad293细胞后，荧光显微镜下可见细胞内绿色荧光蛋白表达，细胞感染率可达90%以上(图1)。病毒经扩增后，TCID50法测定病毒滴度达到4.75 X 1010pfu/ml，HPLC 测定颗粒数为 1.85 X 1012,纯度为 81%0
[0042]采用同样方法扩增作为对照的重组绿色荧光蛋白腺病毒(AdGFP，购自AppliedB1logical Materials Inc.,货号 000541A)并保存。
[0043]实施例2.动脉粥样硬化小鼠模型的制备
[0044]采用8周龄ApoE基因敲除(ApoE 7 )小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，断奶后给予高脂喂养。高脂饲料配方:15%脂肪，0.25%胆固醇，84.75%普通饲料。持续喂养8周后完成动脉粥样硬化小鼠模型制备。实验结果显示，与正常小鼠血管比较，apoE-/-小鼠经高脂喂养8周后可见明显动脉粥样硬化斑块突入管腔，管壁凹凸不平，内膜明显增厚，斑块中可见脂质空泡，为胆固醇结晶，大量炎性细胞浸润(图2)。以上结果表明小鼠动脉粥样硬化模型制备成功。
[0045]实施例3.尾静脉注射腺病毒治疗动脉粥样硬化
[0046]将持续高脂喂养8周，已经形成动脉粥样硬化的ApoE-/-小鼠随机分为AdCREG组(η = 20).AdGFP组(η = 20)和生理盐水对照组(η = 20)。测定每种指标的小鼠数为3 —5只。AdCREG组经尾静脉注射滴度为4.75X1010个病毒空斑形成单位(PFU)的AdCREG的生理盐水lml。AdGFP组经尾静脉注射滴度为4.75X1010PFU的AdGFP的生理盐水lml。生理盐水对照组经尾静脉注射生血理盐水lml。继续喂养8周后，脱颈处死小鼠，取主动脉血管。
[0047]对已经取材的血管，进行重组腺病毒感染效率的鉴定。本发明中，重组腺病毒AdGFP带有绿色荧光蛋白(GFP)基因，重组AdCREG也含有GFP基因，经GFP抗体行免疫荧光染色，可在荧光显微下观察到血管壁中的绿色荧光表达，通过图像分析绿色荧光表达比例，可计算在体情况下，尾静脉注射腺病毒的感染效率。具体方法如下:动物血管标本取出后，PBS清洗干净。用4%多聚甲醛固定30min。加入7.5%蔗糖脱水，4°C过夜。用冰冻包埋剂0TC包埋，置于冰冻切片机中速冻。超薄切片机间断均匀切片，切片厚度5 μ m。用0.2% Triton X-100通透30min。用含5%山羊血清的封闭液室温封闭lh。加入GFP、CREG一抗(购自美国Abeam公司，1:100稀释)4°C孵育过夜。PBS洗3次，每次5min。加入羊抗小鼠的荧光二抗(1: 100稀释)，室温孵育2h。PBS清洗3次，每次5min。荧光显微镜下观察GFP的表达，采集图像，并用Image pro plus软件分析图像，计算感染效率。实验结果显示，感染腺病毒后，在血管壁的内膜、中层、外膜均可见大量GFP阳性细胞，约占所有细胞数的70%。在GFP阳性细胞的位置可见发红色荧光的CREG阳性细胞(图3A)。说明在感染成功的AdCREG腺病毒细胞中成功表达了 CREG蛋白。
[0048]为进一步了解AdCREG尾静脉注射后，感染后的主动脉CREG的表达情况，采用Western Blot检测感染不同时间点(1周，2周，3周，4周)主动脉CREG及GFP的表达。具体方法如下:分