含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组合物的制作方法
【专利说明】含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组合物 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组合物，更具体地， 涉及一种含有至少两种具有甲型流感病毒中和活性的人单克隆抗体的组合物，所述单克隆 抗体由源自甲型流感病毒感染痊愈的患者血液中的人B细胞产生。 【【背景技术】】
[0002] 流感是一种由流感病毒引起的呼吸道感染性疾病，通常发生于冬季。已知其 具有非常高的感染性并会影响所有年龄段，尤其是老年人（Treanor J，2004，N Engl J. Med. 350(3) :218-20)。流感病毒是属于正黏病毒科的包膜RNA(核糖核酸）病毒，其 基因组由八条反义单股RNA(核糖核酸）区段构成。这些流感病毒被分为甲型、乙型和丙 型。基于主要表面蛋白血球凝集素（HA)和神经氨酸酶（NA)，甲型流感病毒进一步分为 各种亚型。截止目前，已鉴定有17种HA和10种NA (Cheung TK和Poon LL 2007, Ann N Y Acad. Sci. 1102:1-25 ;Tong S，等 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 109:4269-4274) 〇 根据其类型的不同，流感病毒可感染鸟类、猪以及人类，且由于基因组由RNA区段构 成这一原因，其基因会持续突变和重组，导致新的遗传变异（Treanor J，2004.N Engl J. Med. 350 (3) : 218-20)。鉴于这种持续突变，难以获得针对流感病毒的永久免疫力，因此目 前认为最有效的预防方法是施用一种针对当年预计要流行的特定类型流感病毒的疫苗以 产生针对当年流感病毒的免疫力。
[0003] 目前每年施用的流感病毒疫苗是含有甲型流感Hl、H3亚型HA和乙型流感HA的三 价疫苗。
[0004] 通常利用鸡蛋来制备抗流感病毒的疫苗，但该制备方法费时且低效。因此，该方法 的问题在于每年难以在有限的时间段内生产足够量的疫苗。为了解决这个问题，多个制药 公司（GSK、百特（Baxter)等）在积极研究通过细胞培养来生产疫苗的方法。此外，如果发 生大规模的流感病毒感染，则很难在短期内生产出抵御该感染的疫苗。同样，由于出现了耐 药性突变病毒株的问题，抗病毒药物并非完全可靠。
[0005] 为了克服这个问题，目前积极开发了抗流感病毒的抗体（Throsby等，2008, PloS One 3 (e3942) ;Sui 等，2009,Nature structural&molecular biology.16(265-273); Simmons 等，2007, PloS Medicine 4 (el78) ;Wrammert 等，2011，J Exp Med. 208 (181-193); Corti 等，2011，Science 333(850-856))
[0006] 采用痊愈患者的血制品来治疗感染了各种病毒的患者并治疗大规模流感感染。例 如，当感染了西班牙流感病毒的患者有肺炎症状，则从感染该流感病毒并痊愈的患者处采 集血制品以用于治疗流感病毒（Luke 等，2006. Annals of internal medicine. 145:599)。 同样，从人血浆中纯化超免疫球蛋白（IgIv)并用于治疗感染了各种病毒的患者，但是上述 得到的产品可能因血液内潜在的感染性物质而不安全，且大规模生产的效率较低。
[0007] 申请人最近申请专利保护的抗甲流病毒抗体对多种流感亚型显示出中和活性。具 体地，韩国专利申请（10-2011-0020061)中公开的抗体主要对系统发育群（phylogenetic group) I (H1、H2、H5和H9)表现出中和活性，韩国专利申请（10-2012-0107512)中公开的抗 体主要对系统发育群2 (H3和H7)表现出中和活性。因此，本发明人对开发含有至少两种抗 体的鸡尾酒制剂进行了研究，所述抗体对属于群1和2的所有病毒（可能会流行的）表现 出预防和治疗效果。
[0008]【内容】
[0009]【技术问题】
[0010] 本发明的目的之一在于提供一种含有至少两种甲型流感病毒中和结合分子的组 合物，所述组合物对系统发育群1和系统发育群2表现出中和活性。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种通过施用所述组合物而诊断、预防或治疗由甲型 流感引起的疾病的方法。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种利用所述组合物诊断甲型流感病毒感染的方法。
[0013] 本发明还有另一目的在于提供一种用于诊断甲型流感病毒的试剂盒，其含有所述 的组合物。
[0014] 【技术方案】
[0015] 为了达成上述目的，本发明提供了一种组合物，其含有至少两种结合于甲型流感 病毒血球凝集素（HA)蛋白干区（stem region)表位的甲型流感病毒中和结合分子，所述组 合物含有：
[0016] i)第一结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H2、H5和 H9 ;和
[0017] ii)第二结合分子，其可中和至少一种选自下组的甲型流感病毒亚型：H1、H3、H5、 H7 和 H9。
[0018] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子的表位可含有HAl多肽第18、38、 40、291、292和318位的氨基酸残基。此外，第一结合分子的表位可含有HA2多肽第18、19、 20、21、41、42、45、48、49、52 和 53 位的氨基酸残基。
[0019] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子的表位可含有HAl多肽第18、38、 40、291、292和318位的氨基酸残基，且可含有HA2多肽第18、19、20、21、41、42、45、48、49、 52和53位的氨基酸残基。
[0020] 在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子的表位可含有HAl多肽第278和318 位的氨基酸残基。此外，所述第二结合分子的表位可含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、 49、52和53位的氨基酸残基。此外，所述第二结合分子的表位可含有HA第一单体的HAl多 肽和/或HA2多肽诸位置的氨基酸残基，还可含有邻近该第一单体的第二单体的HAl多肽 第25、32和33位的氨基酸残基。
[0021] 在本发明的一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HAl多肽第278和318位 的氨基酸残基，且还可含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、49、52和53位的氨基酸残基。 在另一实施方式中，第二结合分子的表位可含有第一 HA单体的HAl多肽和HA2多肽诸位置 的氨基酸残基，且还可含有邻近该第一单体的第二单体的HAl多肽第25、32和33位的氨基 酸残基。
[0022] 在本发明的一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HAl多肽第278和318位 的氨基酸残基，且还可含有HA2多肽第38、39、41、42、45、48、49、52、53、58和99位的氨基酸 残基。在另一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HA第一单体的HAl多肽和HA2多肽 诸位置的氨基酸残基，且还可含有邻近该第一单体的第二单体的HAl多肽第25、27、32和33 位的氨基酸残基。
[0023] 在本发明的一实施方式中，第二结合分子的表位可含有HAl多肽第54、55、278、 291和318位的氨基酸残基，且还可含有HA2多肽第19、20、21、38、39、41、42、45、46、48、49、 52、53、56、57和60位的氨基酸残基。在另一实施例中，所述第二结合分子的表位可含有HA 第一单体的HAl多肽和HA2多肽诸位置的氨基酸残基，且还可含有邻近该第一 HA单体的第 二HA单体的HAl多肽第25、32、33、310、311和312位的氨基酸残基。
[0024] 所述表位的氨基酸位置的编号基于H3HA的编号。
[0025] 本发明结合分子可抑制病毒和靶细胞膜的融合。此外，本发明结合分子可通过抗 体的Fc功能（即ADCC和⑶C)抑制病毒。
[0026] 本发明第一结合分子可结合甲型流感病毒或其片段，其结合亲和力（Kd)低于 L 0 X 10 SM，优选低于L 0 X 10 9M,较优选地，低于L 0 X 10 1QM，更优选地，低于L 0 X 10 nM， 最优选地，低于1.0X10 12M。
[0027] 本发明第二结合分子可结合甲型流感病毒或其片段，其结合亲和力（Kd)低于 L 0 X 10 6M,优选低于L 0 X 10 7M,较优选地，低于L 0 X 10 SM，更优选地，低于L 0 X 10 9M,还 要优选地，低于I. 0 X 10 WM，愈加优选地，低于I. 0 X 10 nM，最优选地，低于I. 0 X 10 12M。
[0028] 结合亲和力（Kd)可通过采用表面等离子体共振测得，例如，BIAC0RE系统。
[0029] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子对于Hl亚型的EC5。值可为2. 0 μ g/ ml或更低，对于H2亚型的EC5。值为7. 0 μ g/ml或更低，对于H5亚型的EC 5。值为7. 0 μ g/ml 或更低，或对于H9亚型的EC5。值为4. 0 μ g/ml或更低。
[0030] 在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子对于H3亚型的EC5。值可为40. 0 μ g/ ml或更低，对于H5亚型的EC5。值为212. 0 μ g/ml或更低，对于H7亚型的EC 5。值为8. 0 μ g/ ml或更低，或对于H9亚型的EC5。值为8. 0 μ g/ml或更低。
[0031] 在本发明的一实施方式中，所述组合物对于Hl亚型的EC5。值可为3. 0 μ g/ml或更 低，对于H2亚型的EC5。值为13. 0 μ g/ml或更低，对于H3亚型的EC 5。值为70. 0 μ g/ml或更 低，对于H5亚型的EC5。值为9. 0 μ g/ml或更低，对于H7亚型的EC 5。值为14. 0 μ g/ml或更 低，或对于H9亚型的EC5。值为6. 0 μ g/ml或更低。
[0032] 所述ECm值可通过微量中和法测定。
[0033] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子包括任一选自下组的多肽序列：i) 包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 1所示CDRl区、SEQ ID NO. : 2所示CDR2区和SEQ ID NO. : 3所示CDR3区的序列；ii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 4所示CDRl区、 SEQ ID NO. :5所示CDR2区和SEQ ID NO. :6所示CDR3区的序列；iii)包括根据Kabat法 确定的 SEQ ID NO. : 7 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 8 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 9 所示 CDR3 区的序列；iv)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 10所示CDRl区、SEQ ID NO. : 11所示 CDR2区和SEQ ID NO. : 12所示CDR3区的序列；V)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 13 所示CDRl区、SEQ ID NO. : 14所示CDR2区和SEQ ID NO. : 15所示CDR3区的序列；vi)根据 Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 16 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 17 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 18 所示⑶R3区的序列。
[0034] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat 法确定的 SEQ ID NO. :1 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 2 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 3 所示 CDR3 区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. :4所示CDRl区、SEQ ID NO. :5所 示 CDR2 区、和 SEQ ID NO. :6 所示 CDR3 区。
[0035] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 7 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 8 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 9 所示 CDR3 区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 10所示CDRl区、SEQ ID NO. : 11 所示CDR2区和SEQ ID NO. : 12所示CDR3区。
[0036] 在本发明的一实施方式中，所述第一结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 13 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 14 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 15 所 示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 16所示CDRl区、SEQ ID NO. : 17 所示 CDR2 区和 SEQ ID Nd : 18 所示 CDR3 区。
[0037] 在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子包括任一选自下组的多肽序列：i) 包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 19所示CDRl区、SEQ ID NO. : 20所示CDR2区和SEQ ID NO. : 21所示CDR3区的序列；ii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 22所示CDRl区、 SEQ ID NO. :23所示CDR2区和SEQ ID NO. :24所示CDR3区的序列；iii)包括根据Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 25 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 26 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 27 所示 CDR3区的序列；iv)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 28所示CDRl区、SEQ ID NO. : 29 所示CDR2区和SEQ ID NO. : 30所示CDR3区的序列；V)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 31 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 32 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 33 所示 CDR3 区的序列； vi)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. : 34所示CDRl区、SEQ ID NO. : 35所示CDR2区和 SEQ ID NO. :36所示CDR3区的序列；vii)包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. :37所示 CDRl区、SEQ ID NO. : 38所示CDR2区和SEQ ID NO. : 39所示CDR3区的序列；和viii)包括 根据 Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 40 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 41 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. :42所示CDR3区的序列。
[0038] 在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 19 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 20 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 21 所 示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. :22所示CDRl区、SEQ ID NO. :23 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. :24 所示 CDR3 区。
[0039] 在本发明的一实施方式中，所述第二结合分子含有：轻链可变区，包括根据Kabat 法确定的 SEQ ID NO. : 25 所示 CDRl 区、SEQ ID NO. : 26 所示 CDR2 区和 SEQ ID NO. : 27 所 示CDR3区；和重链可变区，包括根据Kabat法确定的SEQ ID NO. :28所示CDRl区、SEQ ID