接，然后转化E.coli.D册a感受态，在含 30yg/mL卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜，挑取单克隆在LB液体培养基中扩增培养。
[0057] 由于两个平末端的连接具有正反方向性问题，因此设计一对引物对连接的方向性 进行鉴定，引物分别选自于载体和融合基因片段上。利用菌液PCR的方法筛选出的阳性克 隆，即为治疗性前列腺癌核酸疫苗的质粒pSVKl-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7 (简称疫苗 质粒）。
[0058] 6.疫苗质粒的真核表达
[0059] 采用常规实验方法将疫苗质粒瞬时转染293T细胞，然后采用流式细胞术检测疫 苗质粒在293T细胞的表达。收集转染4化后的293T细胞，用PE标记的抗人CD154 (CD40L) 单克隆抗体和FITC标记的抗人CD80度7-1)单克隆抗体进行避光解育后，进行流式细胞术 检测，检测结果如图4所示。
[0060]将疫苗质粒注射入BALB/c小鼠肌肉组织（股四头肌），然后用ECM830型电脉冲导 入仪进行刺激，3化后颈椎脱白法处死免疫小鼠，手术分离小鼠免疫部位的肌肉组织，经过 固定、包埋、切片、抗体解育、染色等步骤，观察重组质粒注射部位肌肉组织外源基因的表达 情况。应用兔抗人PSCA、PAP、PSA、PSMA单克隆抗体分别进行免疫组化试验后，均可在免疫 小鼠的肌肉组织中观察到数量不同的栋褐色颗粒，而用生理盐水免疫的小鼠的肌肉组织中 则没有检测到目的蛋白的表达（图5)。W上结果表明，疫苗质粒经过肌肉注射加电脉冲刺 激后其融合基因可W在小鼠体内有效表达。
[0061] 实施例2治疗性前列腺癌核酸疫苗免疫原性检测 [00的]实验材料
[0063] 疫苗质粒pSVKl-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7为本部分第一节构建；感受态大 肠杆菌E.COli.D册a为本公司制作；6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动 物有限公司。合成肤是用于免疫学检测中化ISPOT和细胞因子分泌实验的刺激物合成肤由 北京赛百盛生物技术有限公司完成。去内毒素质粒大量提取试剂盒购自天根生化科技（北 京）有限公司，RPMI1640培养基为GibcoB化公司产品，小鼠淋己细胞分离液购自天津織 洋生物制品科技有限公司，MurineIFN-丫ELISPOT预包被试剂盒购自深圳达科为公司，其 它试剂均为国产分析纯。
[0064] 实验方法
[0065] 1.大量提取与纯化免疫用质粒DNA
[0066] 动物实验所需无内毒素质粒pSVKl空载体、佐剂质粒pSVKl-GBW及疫苗质粒 pSVKl-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7均参照天根生化科技（北京）有限公司"无内毒素质 粒大提试剂盒"说明书操作。
[0067] 2.实验动物分组
[006引 6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组8只。A组为空白对照 组；B组为生理盐水注射组；C组为pSVKl空载体组；D组为pSVKl-GB佐剂组；E组为pSVKl-Fk4P-CD40kIRES-GM-CSF+B7 疫苗组。
[006引 3.免疫策略
[0070] 实验小鼠每隔7天，进行3次疫苗免疫，免疫采用股四头肌肌肉注射并同时进行电 脉冲刺激的方式进行，A组为空白对照组，无需注射，B组注射生理盐水100y以C、D、E组分 别注射相应质粒50yg/100yL/只，在注射后立即用活体基因电转仪在注射部位进行多点 电脉冲刺激，电脉冲刺激的条件为：电压60V，脉冲时间50ms，脉冲次数为mzX6次。
[0071] 4.ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体
[0072] 末次免疫后的第2周取各组免疫小鼠血并分离血清。分别用PSCA，PSMA，PSA和 PAP融合蛋白包被化ISA板，检测疫苗免疫后诱导的特异性抗体水平。经过测量各组血清 ELISA后的OD值，结果可W看出疫苗组诱导产生的4种抗体水平均高于各个对照组（图6)， 表明该疫苗能够诱导产生高滴度的抗体。
[0073] 5.ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞特异IFN- 丫的分泌
[0074] 5. 1分离免疫小鼠脾脏淋己细胞悬液：
[00巧]a.在末次免疫后第2周，断颈处死各组免疫后小鼠，浸泡于75%乙醇中5min后放 入紫外线照射消毒过的超净台内；
[0076]b.无菌条件下手术取出小鼠脾脏，将脾脏剪碎后置入200目细胞筛中，接着将细 胞筛放入无血清的1640培养基的平皿中，用研磨棒尽量将脾研磨均匀；
[0077] C.用无血清的1640培养基轻轻将细胞筛中的淋己细胞冲出；
[0078] d.将5mL小鼠淋己细胞分离液加入到离屯、管中，将步骤C所得到的脾细胞悬液 沿管壁缓慢滴加在淋己细胞分离液上方（注意不要将两者混合），室溫下2500巧m离屯、 SOmin；
[0079]e.离屯、后取液体分为=层，取中层白膜，加入IOmL无血清的1640培养基清洗淋己 细胞2次（150化pm/min,IOmin);重悬于10血无血清培养基中并计数。
[0080] 5.沈LISPOT法检测免疫小鼠脾细胞IFN- 丫分泌
[0081] 按照达科为生物技术有限公司的MouseIFN-丫precoatedELISPOT试剂盒进行 操作，具体如下：
[0082] 第一天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）
[0083] 1.预包被板的活化：每孔加入200yLEZ-化ItureTM无血清培养基或者 RPMI-1640培养基，室溫静置5-lOmin后将其扣出。
[0084] 2.加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，IOOiiL/well。正 对照孔：细胞浓度可采用IX105cells/well;负对照孔：细胞浓度可采用IXIOScells/ well;背景负对照：加入重悬细胞用培养基巧Z-化ItureTM无血清培养基或含胎牛血清的 RPMI-1640培养基）；实验孔：样品细胞浓度由实验者根据实验自行调整。
[0085] 3.加入刺激物：10yL/well，具体如下：正对照孔：加入阳性刺激剂工作液。负对 照孔【含背景负对照孔】：加入EZ-化ItureTM无血清培养基（或重悬细胞用培养基）；实验 孔：加入实验者自己的刺激物（用EZ-化ItureTM无血清培养基或者RPMI1640配制成10X 终浓度）。
[0086] 4.解育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37°C，5%C02培养箱培养 16-20hr〇
[0087] 第二天：培养后操作（不再需要无菌操作）
[0088] 1.裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加冰冷的去离子水，200yL/well，4°C冰箱 放置IOmin低渗裂解细胞。
[0089] 2.洗板：倾倒孔内液体，1XWashingbuffer, 200yL/well，洗涂5-7次。每次停 留30-60S。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0090] 3.检测抗体解育：将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100yL/ well。37°C解育 1 虹。
[00川 4.洗板：倾倒孔内液体，1XWashingbuffer, 200yL/well，洗涂5次。每次停留 30-60s。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0092] 5.酶联亲和素解育：将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100yL/well。 37°C解育1虹。
[009引6.洗板：倾倒孔内液体，1XWashingbuffer, 200yL/well，洗涂5次。每次停留 30-60s。最后一次，在吸水纸上扣干。
[0094] 7.显色：将现配的AEC显色液工作液加入各实验孔，100yL/well。室溫避光静置 15-45min(在20-25°C，显色25min较合适）。若室溫低于20°C，建议在37°C解箱做显色，每 隔5-lOmin检查一次。
[0095] 8.终止显色：倾倒孔内液体，掲开板底座，用去离子水/自来水洗涂正反面及底座 3-5遍，终止显色。将板放置在室溫阴凉处，待其自然惊干后合上底座。
[0096] 9.ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。
[0097] 分别W4种抗原的peptidespool为刺激原，加入到实验孔，浓度为1Jig/孔。 ELISPOT的实验结果如图7、图8所示：疫苗质粒组免疫组小鼠能检测到特异性淋己细胞的 IFN-丫分泌，佐剂组能检测到非常低的非特异性的IFN-丫分泌，其他对照组均为阴性。经 过统计学分析，比较分别经过4种peptidespool刺激的不同各组小鼠化ISPOT实验后产 生的斑点数，免疫后的疫苗质粒组较生理盐水组存在显著性差异（P< 0. 001)。实验结果表 明，疫苗质粒能够诱导强烈的细胞免疫反应。
[0098] W上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的 技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种前列腺癌核酸疫苗，其特征在于，所述核酸疫苗由前列腺癌抗原PSCA，PAP， PSMA，PSA的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域融合而成，其上游融 合表达FLT3L的信号肽及胞外区，其下游融合表达⑶40L。2. 根据权利要求1所述的前列腺癌核酸疫苗，其特征在于，所述前列腺癌核酸疫苗的 基因序列如核苷酸序列表SEQIDNO: 1所示。3. 包含权利要求1或2所述的前列腺癌核酸疫苗的质粒载体。4. 根据权利要求3所述包含前列腺癌核酸疫苗的质粒载体，其特征在于，所述质粒载 体的原始质粒载体为pSVKl。5. 权利要求1或2所述前列腺癌核酸疫苗在制备抗前列腺癌的药物中的应用。6. 根据权利要求5所述的前列腺癌核酸疫苗在制备抗前列腺癌的药物中的应用，其特 征在于，所述药物包括权利要求1或2所述前列腺癌核酸疫苗和共刺激佐剂，所述共刺激佐 剂包括细胞因子，趋化因子和细菌毒素。7. 根据权利要求6所述的前列腺癌核酸疫苗在制备抗前列腺癌的药物中的应用，其特 征在于，所述细胞因子为细胞因子GM-CSF和B7. 1。
【专利摘要】本发明公开了一种前列腺癌核酸疫苗。该核酸疫苗由前列腺癌抗原PSCA，PAP，PSMA，PSA的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域融合而成，其上游融合表达FLT3L的信号肽及胞外区，其下游融合表达CD40L。本发明将前列腺癌4种抗原进行融合表达,同时辅以各种共刺激分子和分子内佐剂，提高了该核酸疫苗的免疫原性，增强其抗肿瘤免疫效果。通过实验结果可以看出，该融合表达模式的核酸疫苗，免疫后的小鼠能够同时诱导抗体反应和细胞免疫，细胞免疫反应尤为强烈。
【IPC分类】A61P35/00, A61K39/00, A61K48/00, C12N15/63
【公开号】CN105343874
【申请号】CN201510765091
【发明人】王宇, 李忠明
【申请人】固安鼎泰海规生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月11日