鼻咽癌的新诊治靶点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及分子生物学领域，具体的设及鼻咽癌的新诊治祀点及其应用，更具体 的设及VPSll基因及其调控miRNA在诊治鼻咽癌中的用途。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌（化SO地aryngealcarcinoma,NPC)是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤之 一，其中男性发病率约是女性的两倍，W40-50岁为该病高发期。鼻咽癌发病与遗传因素 (遗传易感性）、邸病毒感染、环境因素、饮食习惯等多种因素有关，早期诊断、早期治疗是 挽救患者生命和提高生活质量的最有效手段。遗憾的是，鼻咽癌起病隐匿，具有强烈的转移 倾向。此外，低分化鱗状细胞癌是鼻咽癌最为常见的病理类型，但是，单纯放疗后五年生存 率仅为50%左右，治疗后复发或转移预后很差，成为鼻咽癌治疗失败的主要原因。因此，识 别和鉴定与鼻咽癌相关的肿瘤标记物，争取早期发现、选择最佳治疗方案、预测预后、监测 复发或转移对鼻咽癌诊疗具有重要的临床意义。
[0003]miRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA。通常由 RNA聚合酶II(PolII)转录生成。miRNA与祀mRNA的典型作用方式主要有两种。在大多 数情况下，复合物中的单链miRNA与祀mRNA的3'UTR不完全互补配对，阻断祀基因的翻译， 从而调苄基因表达。运种方式主要影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。另一种作 用方式与SiRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过切割mRNA直接导 致其降解，实现基因沉默。WSiRNA参与的RNAi为例：SiRNA可与RISC结合，作为模板识 别mRNA祀子，通过碱基互补配对原则，mRNA与SiRNA中的反义链结合，置换出正义链。双 链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA，SiRNA继续同RISC 形成复合体，与SiRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。运个过程也称为转录后基 因沉默（PTG巧。
[0004] 总么当前认为miRNAW何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程 度有关。miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就W抑制目的基因的表达发挥作用；miRNA 与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。另 夕KmiRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化，从而影响祀基因的表达。除 此外，近来发现快速脱腺巧酸化（accelerateddeaden^ation)是miRNA抑制基因表达的 新机制。在哺乳动物细胞中发现miR-12化和let-7能够促进mRNA聚腺巧酸尾己（polyA tail)的去除。用3'组蛋白茎-环结构取代聚腺巧酸尾己，不但可W消除miR-12化对mRNA 含量的影响，还可W降低对蛋白质合成的作用，可见miRNA能通过降低翻译效率和聚腺巧 酸化mRNA的浓度来抑制基因表达。
[0005] 发明通过高通量测序分析鼻咽癌组织及癌旁组织，获得其mRNA和miRNA转录组信 息，经分析筛选出选取VPSll基因和miR-363进行巧光定量PCR验证及祀标验证，结果显 示，VPSll基因和miR-363与鼻咽癌密切相关，在鼻咽癌中VPSll是miR-632的祀基因。本 发明为临床诊断及预防检测鼻咽癌提供了新的祀点，具有很好的应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供VPSll基因和/或蛋白在制备治疗或诊断鼻咽癌试剂中的 应用。
[0007] 本发明的目的在于提供调控VPSll基因和/或蛋白表达的制剂在制备治疗鼻咽癌 试剂中的应用。
[0008] 进一步，所述治疗鼻咽癌试剂是指可W促进VPSll基因的表达的试剂。本领域人 员熟知促进基因的表达通常可W采用下述方法中的一种和/或几种：通过DNA水平调控 VPSll基因：包括但不限于增加VPSll基因的拷贝数、转染含VPSll基因的过表达载体；通 过转录水平调控VPSll基因：包括但不限于激活VPSll基因的表达、激活调控VPSll基因 表达的启动子、抑制负调控VPSll基因表达的转录因子、采用RNA干扰技术对抑制VPSll基 因表达的抑制子进行干扰；通过转录后水平调控VPSll基因：包括但不限于抑制促进VPSll 基因mRNA降解的microRNA转录表达、导入促进VPSll基因表达的microRNA;通过翻译后水 平调控VPSll基因：包括但不限于导入促进VPSll基因编码蛋白的分子、抑制负调控VPSll 基因表达的蛋白、促进VPSll基因表达的因子及蛋白的表达。
[0009] 优选的，所述的治疗鼻咽癌试剂中含有促进VPSll基因表达的载体。
[0010] 本发明的目的在于提供检测VPSll基因和/或蛋白的制剂在制备诊断鼻咽癌试剂 中的应用。
[0011] 进一步，所述诊断鼻咽癌试剂包括用巧光定量PCR方法、基因忍片方法检测鼻咽 癌中VPSll基因的表达。
[0012] 所述的用于巧光定量PCR方法检测鼻咽癌中VPSll基因的产品含有一对特异性扩 增VPSll基因的引物；所述的基因忍片包括与VPSll基因的核酸序列杂交的探针。
[0013] 进一步，所述的鼻咽癌的诊断制剂包括用免疫方法检测VPSll蛋白的表达。优选 所述免疫检测方法检测鼻咽癌中VPSll蛋白表达的为westernblot和/或化ISA和/胶 体金检测方法。
[0014] 进一步，所述检测VPSll蛋白的化ISA法为使用ELISA检测试剂盒。所述试剂盒 中的抗体可采用市售的VPSll单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被VPSll单克隆 抗体的固相载体，酶标二抗，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涂液，酶反应终 止液等。
[0015] 进一步，所述检测VPSll蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用 市售的VPSll单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或 胶体金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区（T)喷点有抗 VPSll单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0016] 本发明的目的在于提供一种检测鼻咽癌的巧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒检测基因VPS11，采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO. 4， 下游引物序列为SEQIDNO. 5。
[0017] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[001引进一步，上述巧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、巧光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO. 4， 下游引物序列为SEQIDNO. 5。所述内参引物为0-actin内参引物。
[0019] 本发明的目的在于提供VPSll基因和/或蛋白的调控miRNA在制备预防、诊断和 /或治疗鼻咽癌试剂中的应用。
[0020] 本发明的目的在于提供检测VPSll基因和/或蛋白的调控miRNA制剂在制备诊断 鼻咽癌试剂中的应用。
[0021] 本发明的目的在于提供调节VPSll基因和/或蛋白的调控miRNA试剂在制备治疗 鼻咽癌试剂中的应用。
[0022] 所述的调控miRNA为mir-632和/或miR-632。mir-632的序列见序列表沈QID NOl;mir-632的成熟miRNA为miR-632序列见序列表沈QIDNO2。
[0023] 进一步，所述的预防、诊断鼻咽癌试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量 PCR方法和/或基于探针杂交方法检测鼻咽癌样本中mir-632和/或miR-632的转录或基 于免疫检测方法检测鼻咽癌样本中miR-632调控的祀基因的表达情况，优选采用nodhern 杂交方法、miRNA表达谱忍片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细 胞术检测鼻咽癌样本中mir-632和/或miR-632的转录；采用ELISA和/或胶体金试纸 条检测鼻咽癌样本中miR-632调控的祀基因的表达情况。优选所述miR-632调控的祀基 因为ENPP4,PDZD2,ATP1A2,TMEM9B，ARHGAP11A，MSLN，CR1，CRY2,MAPK14,CTNS，ADRA2A， SWAP70,TMEM184B，S肥D1，KCNJ16,PLAC8,PGK1，P0U2AF1，SMPD3,RBM38,VPS11，化SCR4， SGTA，ST6GAL1，SMPDl，ClOorfSl,ITIH5,LIMD2,JHDM1D，EIF3J，MS4A1，CD22,SPAG6,CD40LG， MRPL19,更优选的miR-632调控的祀基因为VPS11。
[0024] 优选的，所述的基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-632和/或miR-632的引 物，进一步优选，特异性扩增miR-632引物序列为SEQIDNO3;所述的基于探针杂交方法 包括与mir-632和/或miR-632的核酸序列杂交的探针；所述免疫检测方法包括与miR-632 调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。
[00巧]进一步，所述的治疗鼻咽癌的试剂为下调mir-632和/或miR-632的转录和/或 阻断miR-632的活性的试剂。
[0026]优选的，采用反义寡核巧酸、antagomiRs、miRNA海绵、miRNAlasers、Target Masking和/或多祀点反义寡核巧酸的方法下调mi;r-632和/或miR-632的转录和/或阻 断miR-632的活性。
[0027] 本发明的目的还在于提供一种