一种二色补血草乙酸乙酯提取物的新用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种二色补血草乙酸乙酯提取物的新用途，尤其是在治疗U2-0S型骨肉瘤、L0V0结肠癌、MCF-7乳腺癌方面的新用途。
【背景技术】
[0002]骨肉瘤(Osteosarcoma)是起源于骨骼的恶性肿瘤，其发病率在原发性骨恶性肿瘤中占居首位。骨肉瘤患者中75%为青少年，男性患者是女性患者的1.5倍，其恶性程度甚高，容易发生早期肺转移，预后极差，既往一经发现多采取截肢手术治疗，即便如此，患者术后5年存活率也仅为5-20%，这为患者及其家庭带来极大的精神伤害，也为社会乃至国家都带来沉重的经济负担。目前保肢手术辅以大剂量化疗逐步成为骨肉瘤的首选治疗方案，但仍有20-40%患者死于转移。
[0003]结肠癌(cancer of colon)是西欧、北美等发达国家最常见的恶性肿瘤，也是我国九大常见恶性肿瘤之一。在过去30多年的时间里，包括我国在内的多数国家或地区结肠癌发病率呈上升趋势。在我国，因结肠癌死亡者，男性居恶性肿瘤死亡的第5位，女性居第6位。从流行病学的观点看，结肠癌的发病与社会环境、生活方式(尤其是饮食习惯、缺乏体力活动)、遗传因素有关。年龄、结直肠息肉史、溃疡性结肠炎及胆囊切除也是结肠癌的高危因素。
[0004]乳腺癌(ma_ary cancer)通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在妇女仅次于子宫癌，它的发病常与遗传有关，以及40— 60岁之间，绝经期前后的妇女发病率较高，乳腺癌男性罕见，仅约1-2%的乳腺患者是男性。全球每年死于乳腺癌的病例约为41.1万人，是女性癌症死因的第一位。在大多数国家，乳腺癌的发病率呈上升趋势，我国是乳腺癌增长速度最快的国家，增加的幅度每年达3-4%。
[0005]二色补血草(Zi/wwi.AicoJor (Bunge) 0.Kuntze)为白花丹科补血草属越年生草本植物，别名干枝梅、苍蝇花、蝇子草、燎梅蒿，耐盐碱、干旱，抗逆性强，主要分布于我国西北、东北和东部沿海地区。二色补血草全草入药，是常用的传统中草药，性味甘平、微涩而苦、无毒，具有补血止血、调经益气、抗菌消炎、温中健脾的作用。已有研究表明二色补血草中含有黄酮、多糖、挥发油、留体等成分，其中的黄酮类物质有较好的抗氧化能力，多糖对Hela细胞也有很好的抑制作用，地上部提取物对葡萄糖苷酶有较好的抑制作用。
[0006]尽管二色补血草的作用陆续被研究学者发现，但其在治疗骨肉瘤，特别是U2-0S型骨肉瘤，结肠癌、特别是L0V0型结肠癌，乳腺癌，特别是MCF-7型乳腺癌方面的研究仍未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明旨在提供一种二色补血草乙酸乙酯提取物的新用途，尤其是在治疗骨肉瘤，特别是U2-0S型骨肉瘤，结肠癌、特别是L0V0型结肠癌，乳腺癌，特别是MCF-7型乳腺癌方面的新用途。
[0008]本发明所述二色补血草原料为二色补血草的全草或二色补血草的花序。
[0009]本发明所述的提取为冷浸或热回流或超声。
[0010]本发明所述的乙醇其浓度为50-100%。
[0011]本发明所述二色补血草乙酸乙酯提取物是以二色补血草为原料，用乙醇进行提取，提取后过滤，滤液浓缩至无醇味后，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯部位进行回收，干燥，所得提取物即为二色补血草乙酸乙酯提取物。
[0012]本发明中所用PBS缓冲液配制方法如下:8 gNaCl，0.2 gKCl，1.44 gNa2HP04，0.20gKH2P04，加超纯水至1000 mL，调节PH7.2-7.4，高压高温(121 °C )灭菌20min，4°C冷藏备用。
[0013]本发明中所用胰酶配制方法如下:称取胰蛋白酶粉0.50 g和EDTA 1 g，溶于200mL PBS缓冲液中。低温下搅拌4 h，充分溶解后，调整PH 7.2-7.4。0.22 μ m滤膜过滤除菌，用15 mL试管分装，-20°C冻存备用。
[0014]本发明中所用RPMI1640培养基配制方法如下:将RPMI Medium 1640固体粉末培养基6.75 g溶于500 mL超纯水中，加入32.5 mg青霉素、50 mg链霉素、1 g NaHC03，充分溶解；0.22 μπι滤膜过滤除菌，在超净工作台内向100mL瓶分装，每瓶85 mL，4°C冷藏备用。使用时每瓶加入10 mL马血清、5 mL胎牛血清，配置成15%培养基。
[0015]本发明中所用DMEM培养基配制方法如下:将Dulbecco’s Modified Eagle Medium固体粉末培养基6.75 g溶于500 mL超纯水中，加入32.5 mg青霉素、50 mg链霉素、1 gNaHC03，充分溶解；0.22 #汝滤膜过滤除菌，在超净工作台内向100 mL瓶内分装，每瓶90 mL,4°C冷藏备用。使用时每瓶加入10 mL胎牛血清，配置成10%的培养基。
[0016]本发明中所用F-12K培养基配制方法如下:量取F-12K Nutrient Mixture液体培养基500 mL，加入32.5 mg青霉素、50 mg链霉素，充分溶解；0.22 #放滤膜过滤除菌，在超净工作台内向100 mL瓶内分装，每瓶90 mL，4°C冷藏备用。使用时每瓶加入10 mL胎牛血清，配置成10%的培养基。
[0017]本发明中所用MTT配制方法如下:称取20 mg MTT于5 mL试管中，加入4 mL PBS缓冲液，使用涡旋仪使其完全溶解，即成5 mg/mL MTT液；用0.22 Mm微孔滤器除菌后_20°C冷冻保存。
[0018]本发明中所用酸液配制方法如下:称取120 g重铬酸钾，加入1000 mL超纯水中，加热辅助使其完全溶解；将该溶解液缓慢加入200 mL浓硫酸中，并不断搅拌，至其冷却。
[0019]本发明的步骤如下:
1、细胞株复苏:在敞口瓶中加入蒸馏水，放入38°C恒温水槽中，待其温度恒定后将冻存于-198°C液氮中的细胞取出，快速放入敞口瓶中，晃动，使冻存管内液体于1-2 min内溶化。用酒精棉擦拭冻存管，放入工作台内，将细胞液吸入15 mL试管内，同时加入10 mL该细胞株的新鲜培养基，1000 rpm离心4 min。弃去上清液，移液枪注入1 mL新鲜培养基吹打分散后，注入已装有7 mL新鲜培养基的培养瓶内，轻旋盖子，于0)2培养箱内培养。
[0020]2、细胞换液:将细胞培养瓶抒紧盖子后从培养箱中拿出，观察瓶内培养基的颜色及是否浑浊，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。用酒精棉将培养瓶擦拭后放入超净工作台，取下盖子，倒掉培养基。用移液枪吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取8 mL新鲜培养基注入培养瓶内，盖上盖子，观察细胞状态。酒精擦拭瓶身及瓶口后放入培养箱内。
[0021]3、细胞消化:将细胞培养瓶抒紧盖子后从培养箱中拿出，观察瓶内培养基的颜色及是否浑浊，于倒置显微镜下观察细胞生长状况。用酒精棉将培养瓶擦拭后放入超净工作台，取下盖子，倒掉培养基。用加样器吸取2 mL PBS打入培养瓶内，盖上盖子后，晃动几次后，倒掉PBS，重复此操作一次。用移液枪吸取1 mL胰酶，注入培养瓶内，旋紧盖子，平放培养瓶使胰酶均能浸润培养面。于倒置显微镜下观察，细胞变成单个圆形，则需要终止胰酶的消化。酒精棉擦拭后放入超净工作台，移液管吸取1 mL新鲜培养基打入培养瓶中，用移液枪吸取培养瓶内液体吹打培养瓶的细胞培养面，液体变成浑浊状态。将该消化后液体移入10 mL试管中，旋紧盖子，1000 rpm离心4 min，弃去上清液。用移液枪吸取2 mL PBS注入试管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液。
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