miR-451a细胞在非小细胞肺癌中的作用

miR-451a细胞在非小细胞肺癌中的作用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种miR-45la细胞在非小细胞肺癌中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并 且每年新增病例120万。其中约80%的肺癌为非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer, NSCLC)，由于缺乏有效的针对肺癌的早期诊断手段，且NSCLC具有较强的转移能力，其5年 存活率仅为15%-30%。对于NSCLC患者及时采取治疗将极大地提高病人的生存率，并改善病 人的健康状况。因而，针对NSCLC早期诊断与肿瘤转移机制的相关研究刻不容缓。
[0003] 微RNA(microRNA，miRNA)功能调控是当前生命科学的重要前沿。miRNA是一类 长约22nt的内源性非编码小分子RNA，其通过特异的祀向作用于编码RNA(mRNA)，在转录 后水平上调控基因表达。miRNA广泛的存在于真核生物中，且大多具有较高的保守性，在哺 乳动物中，约30%的蛋白质编码基因受到miRNA的调控。同时，miRNA在诸多生物进程中发 挥至关重要的作用，例如控制发育，胚胎生成、细胞分化增殖W及调亡等。针对miRNA的相 关功能和机制研究，将是解决人类癌症的发病机理与个性化治疗等问题的关键。
[0004] 经过对已报导文献的总结，W及在小鼠诱导肿瘤模型、人类转移性肺癌组织样品、 常见非小细胞肺癌细胞系中的含量检测，发现miR-451a的表达量相较于正常肺部组织细 胞明显降低，显示了其潜在的抑癌作用。miR-451a在抑制肺癌细胞迁移的过程中发挥重要 的调控作用，同时还参与到多功能转录因子调控网络，成为NSCLC细胞中重要的调控因子。 针对miR-451a作用机制的相关研究，不仅有助于肺癌的早期诊断与治疗策略，并且在控制 NSCLC转移方面具有极大的临床应用价值，为非小细胞肺癌的精准治疗提供新颖的研究方 向和应用指导。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的之一在于提供一种miR-451a基因在制备抑制非小细胞肺癌癌细胞 迁移药物中的应用。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种miR-451a基因在制备下调A549细胞系中CAB39 基因表达水平药物中的应用。
[0007] 本发明的实施步骤如下所述： 1.首先，通过Solexa测序技术，获得miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中的表达差异。然 后，利用qRT-PCR技术，检测了 41组人肺癌组织临床样本与相应的癌旁组织，并将运些样品 按照?M分期进行分类。研究发现，在N0M1分组中，miR-451a表达水平相较于癌旁组织下 降到30. 64%，同时显著性较好P< 0. 0UPValue= 0. 0036)。最后，在正常的肺组织细胞系 Beas-2B和常见的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、Spca-l、Hcc827、95-D中通过qRT-PCR 技术，检测miR-45la表达量的变化。发现miR-45la在各个细胞系中的表达量均显著下降， 并且相较于正常的肺组织细胞系Beas-2B，A549细胞中miR-451a表达量下降最多（下降了 约 4^))。
[0008] 2.过表达miR-451a后，检测其对于A549细胞迁移的变化。在A549细胞中转染 miR-451amimics与mimics化gativeControKNC)，通过细胞划痕实验发现，miR-451a能 够显著地抑制A549细胞的迁移。
[0009] 3.通过在线预测软件starBase化ttp://sta;rbase.sysu.edu.cn/)预测到CAB39 mRNA的3' -UTR中含有miR-451a序列的结合位点。将CAB39野生型3' -UTRW及含有种 子序列突变的3' -UTR构建到pGk3报告基因的下游，通过双巧光素酶报告基因系统，分析 发现带有CAB3野生型3' -UTR报告基因受到miR-451a调控，而突变型则不受miR-451a调 节。最后，在A549细胞中过表达miR-451a，WesternBlot结果证明CAB39受到miR-451a 的调控。上述结果证实，CAB39确为miR-451a的祀基因。
[0010] 4.通过TranswellAssay检测到，在A549细胞中过表达miR-451a将引起细胞迁 移能力的下降，而过表达CAB39则会显著地促进细胞迁移。最终，在A549细胞中同时过表 达miR-451a与CAB39,通过TranswellAssay检测到细胞迁移能力下降。W上结果证实， miR-451a能够有效地回复由CAB39引起的细胞迁移能力增强，其在调节A549细胞迁移的过 程中发挥重要作用。
[0011] 综上所述，miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型、人类转移性肺癌组织样品W及常见的 非小细胞肺癌细胞系中均特异性低表达，为非小细胞肺癌远端迁移的判断提供重要的实 验依据。实验证明，过表达miR-451a能够显著地抑制细胞迁移。同时，通过双巧光素酶报 告基因系统、WesternBlot等实验验证了CAB39基因为miR-451a的祀基因。本实验首次 证实了miR-451a通过下调CAB39基因进而发挥抑制肿瘤细胞迁移的功能，该发现对于肺癌 的扩散、转移与发生、发展机制研究做出一定贡献。
[0012] 本发明的其它方面将在下文有详细的描述。需要指出的是，上述W及下文的各具 体特征的任意组合也在本发明范围之内。
【附图说明】
[001引图1miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型、人类转移性肺癌组织样品W及常见的非小细 胞肺癌细胞系中的表达量 (A)miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中的表达量。其中L822T1是基因型KRAS+/+的良性 肿瘤，L703T2是基因型LKB1 / /KRAS+/+的恶性肿瘤，L903T1为P53 / /KRAS+/+的恶性肿瘤。
[0014] 度）miR-451a在41对肺癌组织临床样本中的表达量，临床样本已按照?M分期进 行分类。
[0015] (C)miR-451a在Beas-2B、A549、H1299、Spca-1、Hcc827、95-D细胞中的表达量。
[0016] 上述结果显示miR-451a在人类转移性肺癌组织及常见肺癌细胞系中的表达量均 明显降低。
[0017] 图2miR-451a对A549细胞迁移的影响 在A549细胞中分别转染NC与miR-451amimics,通过细胞划痕实验检测miR-451a对 于细胞迁移的作用。
[0018] 结果表明，miR-451a能够显著地抑制A549细胞的迁移。
[001 引 图 3miR-451a祀向作用于CAB39 3'-UTR (A)miR-451a与CAB39野生型和突变型3' -UTR结合序列示意图。
[0020] 度）通过双蛋光素酶报告基因系统分析，miR-451a能够下调含有野生型CAB39 3'-UTR的报告基因表达，而对于含有突变型CAB39 3'-UTR的报告基因表达没有影响。 [002。 似在A549细胞中过表达miR-451a，将引起CAB39蛋白水平的下降。分别转染 NC与miR-451amimics,通过WesternBlot检测CAB39 的蛋白含量。
[0022] 上述结果证实，CAB39确为miR-451a的祀基因。
[0023] 图4miR-451a通过CAB39发挥抑制细胞迁移的作用 (A)通过TranswellAssay检测，在A549细胞中过表达miR-451a对于细胞迁移能力 的影响。
[0024] 度）通过TranswellAssay检测，在A549细胞中过表达CAB39对于细胞迁移能力 的影响。
[00巧](C)通过TranswellAssay检测，同时过表达miR-451a与CAB39后A549细胞迁 移能力的变化情况。
[0026]W上结果证实，miR-451a能够有效地回复由CAB39引起的细胞迁移能力增强，并 且在调节细胞迁移中发挥重要作用。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合具体实例进一步阐述本发明。运些实例仅用于阐述本发明，而不用于 限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子 克隆（MolecularCloning:AL油oratoryManual,化(1ed.)中所述的条件，或按照制造 厂商所建议的条件。
[0028] 实施例一：根据Solexa测序结果，确定miR-451a在小鼠诱导肿瘤模型中低表达 本发明所用到的KRAS基因突变小鼠肺癌模型化822T1、L703T2、L903T1)和正常肺癌模 型化1805)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。其中L822T1是基因型KRAS+/+的 良性肿瘤，L703T2是基因型LKB1 / /KRAS+/+的恶性肿瘤，L903T1为P53 / /KRAS+/+的恶性肿 瘤。
[0029] 对正常小鼠的肺组织和诱导癌变的小鼠肺组织分别取样，使用Trizol法提取组 织内总RNA。具体步骤为：WTrizol裂解组织，室溫放置5分钟，使组织充分裂解，获得裂解 液；加入氯仿，縱满震荡15秒，W12000g/4°C离屯、10分钟；离屯、之后吸取上层水相并加入 等量异丙醇颠倒混匀，室溫放置20分钟；再次W12000g/4°C离屯、10分钟，可见白色沉淀， 弃去上清，白色沉淀即RNA;加入75%乙醇洗涂沉淀，2000g/4°C离屯、3分钟；弃去上清液，室 溫干燥沉淀5-10分钟。惊干后WDEPC水溶解沉淀即获得总RNA。
[0030] 随后，对于上述方法获得的总RNA产物，本发明使用Takara公司的化eStep PrimeScriptmiRNAcDNASynthesisKit(CodeNo.D350A)进行逆转录，构建上述组织的 cDNA文库，Woligo化为引物进行逆转录，通过变性反应和逆转录2步获得后续实验所需 的miRNAcDNA文库。本试剂盒可对样品中的miRNA及其它微小非编码RNA进行化ly(A)加 尾反应，从而引入化i-miRqPCRPrimer结合位点，可对样品中的任意miRNA进行定量PCR 反应。具体操作过程如下： (1)配置如下体系：
(2)按上表配置的相应体系，放置于Bio-RadPCR仪上，W37°C-60min，85°C-5s条件 进行逆转录。
[0031] (3)用RNase化ee&0稀释逆转录产物至800μ1，储存于-20°C，用于后续实验。
[0032]miRNA检测使用Takara公司的SYBRPrimeSciptmiRNART-PCRKit(CodeNo. RR716)进行，本试剂中含有化qDM聚合酶、dNTPmixW及SYBRGreendye。该方法使用 的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统。具体操作为： (1) 配置如下体系：
(2) 上机检测：按照下列步骤设定仪器，检测。
[0033]① 95°C, 0:30s; 预变性 ② 95°C, 0:10s; 变性 ③ 53°C, 0:30s; 退火 ④Plate read 读取数据 ⑥Goto2，42X回到步骤2.循环42次 ⑧ 55Γ，0:30s; ⑦55°C, 0:05s +0. 5°C / cycle Ramp 0. 5°C /s; ⑨Plate read; 读取数据 ⑨Goto7，SOX. 回到步骤7.循环80次 W癌旁为正常参照，WU6为内参基因，使用ΔAct法分析检测数据，检测miR-451a在 人类非小细胞肺癌组织临床样本中的表达