用于治疗血管生成依赖性和淋巴管生成依赖性疾病的生物模拟肽和生物可降解的递送平台的制作方法
【专利说明】用于治疗血管生成依赖性和淋己管生成依赖性疾病的生物 模拟化和生物可降解的递送平台
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年6月7日提交的美国临时申请号61/832,290的权益，其通过 引用W其整体并入本文。
[0003] 联邦政府资助的研究或开发
[0004] 本发明根据由美国国立卫生研究院（the化tionalInstitutesofHealth)给予 的R21CA131931和ROlCA138264在美国政府支持下做出。美国政府在本发明中拥有某 些权利。
[0005] 电子提交的材料的通过引用并入
[0006] 本申请包含序列表。该序列表已作为名称为"111232-00291_ST25.txt"的ASCII 文本文件经EFS-WebW电子形式提交。该序列表大小为1，966字节，且创建日期为2014年 6月9日。该序列表在此通过引用W其整体并入。
[0007] 背景
[0008] 癌症是美国和世界其他地区的重要的公共卫生问题。目前，在美国1/4死亡数是 由于癌症。血管生成在大部分类型的癌症的肿瘤生长和转移中起重要的作用。特别地， 其重要性已在美国最常诊断出的女性恶性肿瘤乳腺癌中被证实。抗血管生成疗法作为单 一疗法或与其他疗法组合是有希望的并且正在临床前和临床研究两者中被紧张地研究。 抗VEGF疗法显示了临床试验中的早期希望；然而，尽管在2008年抗VEGF抗体贝伐单抗 (Genentech/Roche)经美国食品与药物管理局（FDA)批准与化疗组合用于乳腺癌，在2011 年11月，抑A撤销了乳腺癌适应症，因为其未显示总存活益处。
[0009] 治疗乳腺癌和其他癌症，W及眼部增殖性疾病，诸如年龄相关性黄斑变性的抗血 管生成疗法的开发正在进行中。淋己管生成在癌症转移中还起重要作用化olopainen等 人，2011)。迄今为止，肤类药物未被批准用于治疗癌症或其他血管生成依赖性疾病和淋己 管生成依赖性疾病。
[0010] 肤已被用作多种疾病的治疗剂并且最近在祀向肿瘤的临床应用中被研究用于成 像或治疗（Fo化man, 2010;Senger等，1983;Leung等，1989 ;Ca;rmeliet, 2005 ;Ca;rmeliet 和Jain, 2000 ;Carmeliet和化in, 2011 ;Rosea等，2011)。模拟肤是生物学上模拟生物 分子上的活性决定簇的肤。通常，由于肤特异性祀向结合、穿透细胞的能力和给予不同 应用的灵活性的修饰方便性，肤作为疗法是有吸引力的工具（Carmeliet和化in, 2000; Folkman，2006)。另外，由于它们W高度特异性结合其祀它们毒性较低且它们生产低廉。
[0011] 然而，使肤成为有吸引力的候选者的特性中的一些也有其缺点。尽管肤可与细胞 受体特异性相互作用，有时运些相互作用可W是低亲和力的。另外，目前肤由于其短的半衰 期和减少的生物利用度作为治疗剂的使用受限。
[0012] 修饰肤W增加其生物利用度的尝试包括肤的非天然氨基酸置换、聚乙二醇化及肤 W纳米粒子和微米粒子递送。
[0013] 概述
[0014] 本发明公开的主题提供了用于治疗与血管生成、淋己管生成、血管通透性和/或 肿瘤发生相关的疾病、素乱或功能障碍的肤组合物、方法和试剂盒。本发明公开的肤组合物 和方法在一些方面抑制在多种疾病或素乱中起关键作用的血管生成、淋己管生成、血管通 透性和/或肿瘤发生。因此，在一些方面，本发明公开的主题的组合物和方法允许预防或减 少牵设细胞、组织或器官的血管、淋己管或肿瘤形成。
[0015] 在一些方面，本发明公开的主题提供了分离的肤，所述分离的肤包含与 LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列，其中所述肤展现出抗 血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋己管生成特性。
[0016] 在其他方面，本发明公开的主题提供了组合物，所述组合物包含药学上可接受的 载体和有效量的分离的肤，所述分离的肤包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至 少85%同一的氨基酸序列，其中所述肤展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/ 或抗淋己管生成特性。
[0017] 在另外的方面，本发明公开的主题提供了试剂盒，所述试剂盒包含分离的肤，所述 分离的肤包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列，其中 所述肤展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋己管生成特性。
[0018] 在仍另外的方面，本发明公开的主题提供了纳米粒子或微米粒子，所述纳米粒子 或微米粒子包含分离的肤，所述分离的肤包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至 少85%同一的氨基酸序列，其中所述肤展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/ 或抗淋己管生成特性。
[0019] 在一些方面，本发明公开的主题提供了用于抑制牵设细胞的血管生成、淋己管生 成、血管通透性和/或肿瘤发生的方法，所述方法包括：使所述细胞与足W抑制牵设所述细 胞的血管生成、淋己管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的量的分离的肤接触，所述分离的 肤包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列。
[0020] 在一些其他方面，本发明公开的主题提供了用于治疗患有与血管生成、淋己管生 成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的受试者，或预防或延迟受试者发展与血管生 成、淋己管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的方法，所述方法包括：将分离的 肤W足W治疗、延迟或预防所述受试者中所述疾病的量施用至所述受试者，所述分离的肤 包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDN0:1)至少85%同一的氨基酸序列。
[0021] 本发明公开的主题的某些方面在上文已被列举，其全部或部分由本发明公开的主 题所解决，其他方面当结合本文W下作为最好描述的所附实施例和图考虑时，随着描述进 行将变得明显。
[0022] 附图简述
[0023] 由此已用一般术语描述本发明公开的主题，现将参考附图，其不一定按比例绘制， 且其中：
[0024] 图1A-1C示出了使用SP2043肤（SEQIDN0:1)与人厮静脉内皮细胞（HUVEC)的 增殖（图A)、附着（图B)和迁移（图C);
[002引图2A-2C示出了使用SP2043肤（SEQIDNO: 1)与人视网膜内皮细胞（HREC)的附 着（图A)、增殖（图B)和迁移（图C);
[0026]图 3A-3D示出 了使用CM对照（图A)和SP2043肤（SEQIDN0:1)但5μΜSP2043肤； 图B)的HUVEC管形成测定（tubeformationassay);和使用对照（Ctrl;图C)和SP2043 肤（SEQIDNO: 1) (25μΜSP2043肤；图D)的微血管内皮细胞（MEC)管形成测定；
[0027] 图4示出了在本文和附图中还称为SE化1的SP2043肤（SEQIDNO: 1)对淋己管 内皮细胞（LEC)附着的影响；
[0028] 图5示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)对淋己管内皮细胞（LEC)管形成的影响；
[0029] 图6A-她示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)对微血管内皮细胞（MEC;图A)和淋己 管内皮细胞（LEC;图B)的肝细胞生长因子化G巧和膜岛素生长因子（IGF1)的体外信号 传导的影响；
[0030] 图7示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)对S阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和 SUM149W及雌激素受体阳性细胞系MCF-7的增殖的影响；
[0031] 图8示出了SP2043肤（SEQIDN0:1)对MDA-MB-231细胞内肝细胞生长因子（HGF) 信号传导的影响；
[0032]图 9 示出了 33 天内SP2043 肤（SEQIDNO: 1)对SCID小鼠内MDA-MB-231 原位肿 瘤生长（ip，腹腔内注射）的影响；
[0033] 图10A-10B示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)(图B)对体内c-Met憐酸化和血管 生成的影响（图A，对照）；
[0034] 图11A-11G示出了SP2043肤（SEQIDN0:1)对血管生成的影响，如通过用于免疫 组织化学（1肥）的凝集素染色和用于体内淋己管生成的LYVE-1染色所见：用凝集素染色的 对照（图A)和用LYVE-1染色的对照（图B);用凝集素染色的SP2043肤（SEQIDNO: 1)(图 C)和用LYVE-1 染色的SP2043 肤（SEQIDNO: 1)(图D);对照和SP2043 肤（SEQIDNO: 1) (图巧；W及使用凝集素（图巧和LYVE-1 (图G)的像素密度；
[0035]图 12A-12B示出了SP2043 肤（SEQIDN0:1)对MDA-MB-231-luc肿瘤在肿瘤条件 介质预处理的转移模型中的多个器官中转移的影响，运通过来自肿瘤细胞的光子通量得到 (图A)，W及SP2043肤（SEQIDN0:1)对MDA-MB-231-luc肿瘤至淋己结的转移的影响，如 通过对于人细胞的存在通过波形蛋白抗体染色所见（图B);
[0036] 图13A-13E示出了SP2043肤（SEQIDN0:1)与在CNV模型中的阿柏西普（图A-B) 相比，和与在rho-VEGF小鼠模型中的对照（图C-巧相比，对新血管形成的影响；
[0037] 图14示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)对激光诱导的CNV模型中小鼠眼睛新血管 系统的影响；
[0038]图 15A-15B示出了SP2043 肤（SEQIDN0:1)对Tet/视蛋白（Opsin)AEGF小鼠 模型中血管渗漏（vascularleakage)的影响；
[0039] 图16示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)对兔眼睛中VEGF介导的血管通透性的影 响；
[0040]图 17示出了聚乳酸-?基乙酸共聚物（poly(lactic-co-glycolicacid)) (PLGA) 微米粒子中负载的SP2043肤（SEQIDN0:1)(2%)的代表性实例；PLGAW65/35的L:G比， MW= 40-75kDa来使用。比例尺为10微米；
[0041]图184-186示出了：（图4)负载2%和5%5口2043 肤（56910^:1)的？11；八微 米粒子和大小（sizing);数目平均粒子分布（Num.Avg)和体积平均粒子分布（Vol.Avg)被 指明（平均值+SD);和（图B)负载2%和5%SP2043肤（SEQIDN0:1)的PLGA微米粒子 的ζ电势（表面电荷）；
[0042] 图19示出了来自PLGA微米粒子的SP2043的标记的肤类似物在生理条件下原位 的控释；
[0043] 图20示出了在PLGA微米粒子中没有任何标记或修饰的SP2043肤（SEQIDN0:1) 在生理条件下的原位控释（W下图32中所示方法）；
[0044] 图21示出了渗入按重量计2%SP2043 (左）和按重量计5%SP2043 (右）的PLGA 微米粒子的沈Μ图。PLGA在该实施例中W85/15的L:G比，MW= 190-240kDa来使用。比 例尺为10微米；
[0045] 图22示出了使用包封进纳米粒子PLGA65/35中的SP2043肤（SEQIDNO: 1)。楠 球形纳米粒子（左）和球形纳米粒子（右）；
[0046] 图23示出了包封SP2043肤（SEQIDNO: 1)的PLGA85/15微米粒子对激光诱导 小鼠模型中脉络膜新血管形成后小鼠眼睛中消退的影响（示出了2周数据）；
[0047] 图24示出了包含SP2043肤（SEQIDNO: 1)的PLGA85/15微米粒子对激光诱导 的湿性AMD小鼠模型中新血管形成随时间的影响；
[0048] 图25示出了包含SP2043肤（SEQIDNO: 1)的PLGA65/35微米粒子对激光诱导 的湿性AMD小鼠模型中新血管形成随时间的影响；
[0049] 图26示出了SP2043肤（SEQIDNO: 1)对兔模型中新血管形成抑制的影响。在玻 璃体内注射进兔眼睛之后第34天的数据；
[0050] 图27示出了在rho/VEGF转基因小鼠中的包封SP2043肤（SEQIDNO: 1)的 PLGA(85/15)；
[0051] 图28示出了与其他抗血管生成剂组合的SP2043肤（SEQIDNO: 1)对小鼠中激光 诱导的脉络膜新血管形成模型的影响；
[0052] 图29示出了聚合物诸如PBAE对SP2043肤（SEQIDNO: 1)自组装成约100-nm 纳米粒子的能力的影响。聚合物447指（3-氨丙基）-4-甲基赃嗦封端的聚（1，4-下二醇 二丙締酸醋-共-4-氨基-1-下醇）且聚合物657指（3-氨丙基）-4-甲基赃嗦封端的聚 (1，6-己二醇二丙締酸醋-共-5-氨基-1-戊醇）度6-S5-E7)。+/-指有或没有SP2043肤 (SEQIDN0:1)。当SP2043肤（SEQIDN0:1)与聚合物一起自组装时，粒径较大且纳米粒 子浓度较大；
[0053] 图30示出了包封SP2043的PLGA纳米粒子和PLGA-PEG纳米粒子；
[0054] 图31A-31B示出了系统静脉内注射的包含SP2043肤（SEQIDN0:1)的纳米粒子 或游离肤对在肿瘤W及其他器官内积累的影响。图31A示出了每一器官的积累且图31B示 出了总积累。在两个图中，术语"裸的"指游离肤，而术语"球形"、"楠球形"和"PEG"即聚 乙二醇，指包含SP2043肤（SEQIDN0:1)的纳米粒子的Ξ种不同的类型；且
[00巧]图32A-32B示出了通过使用电泳和用SimplyBlue染色（图A)随后通过质谱 法（图B)定量本发明公开的肤的方法。图A包含W下样品：泳道1，标志物；泳道2,4μg SP2043肤（SEQIDNO: 1)阳性对照；泳道3,在PBS介质中的4μgSP2043肤（SEQID N0:1);泳道4,在FBS介质中的 4ygSP2043 肤（SEQIDN0:1)。
[0056] 详述
[0057] 本发明公开的主题现将参考附图在下文中被更充分描述，其中示出本发明公开的 主题中的一些而非全部实施方案。同样的数字始终指相同的要素。本发明公开的主题可w W许多不同的形式来体现并且不应该被解释为限于本文阐述的实施方案；相反，提供运些 实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上，本文阐述的本发明公开的主题 的许多修饰和其他实施方案将为本发明公开的主题所属技术领域的技术人员想到具有上 述说明和相关附图中呈现的教导的益处。此外，应该理解，本发明公开的主题不限于公开的 具体实施方案且修饰和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求书的范围内。
[005引I.来源于IV型胶原的模拟肤
[0059] 对于某些疾病，相比于其他类型的疗法，肤通常提供许多优势，由于它们是无免疫 原性的、因为它们W高度特异性结合至其祀而毒性较低，并且生产成本低廉。参见，例如，国 际PCT专利公布号W0 2008/085828和国际PCT专利申请公布号W0 2007/033215,其每个通 过引用W其整体并入本文。本发明公开的肤展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生 和/或抗淋己管生成特性，其可导致某些疾病中总存活率的增加。例如，本发明公开的肤可 有益于癌症患者并可有助于治疗眼部增殖性疾病，诸如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视 网膜病变。
[0060] 通常，本发明公开的肤被表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQ IDNo:2)的基序。表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXNINNVXNF(SEQIDNo:4)的 基序的肤已在国际公布WO2012/079088(通过引用W其整体并入本文）中被公开。该基序 通过做出pentastatin-1肤中的置换来确定。W0 2012/079088出版物公开了，在一些实施 方案中，SEQIDNo:3中由X指示的位置可W是变化的并且所得的肤还可用于，且在一些实 施方案中更好用于抑制血管生成、淋己管生成、血管通透性和/或肿瘤发生，W及其用于治 疗运些病的受试者，而SEQIDNo:3中其他位置可W是不变的W保留抑制特征。在其他实 施方案中，发现了在W下位置上的X可W具有SEQIDNo:3中W下置换：位置7可W是M、 A或G;位置9可W是F、A、Y或G;位置10可W是M、A、G、dA或Nle;位置11可W是F、A、 ￥、0或4-(：1化6;位置12和位置18可^是4扣、6、5、4、￥、1\1、1或4117617。在一个实施 方案中，公开了表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFININNVINF(SEQIDNo:3;还称为 SP2036)的基序的肤。
[0061] 本发明公开的肤被表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQID No:2)的基序，其在位置13和16不同于先前公开的SEQIDNo:4(表1)。在特定的实施 方案中，公开了表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDNo:l;还称为 SP2043和SEQ. 1)的基序的肤，其在位置13和16不同于先前公开的SEQIDNo:3(还称为 SP2036)(表1)。本文公开了位置13和16上的天冬氨酸的置换导致运样的肤，所述肤疏 水性更低，但仍可用于抑制牵设细胞、组织或器官的血管生成、淋己管生成、血管通透性和/ 或肿瘤发生，W及其用于治疗运些病的受试者。另外，由于该肤疏水性更低，更容易产生。 [006引表1.代表性肤
[0063]
[0064]A.代表性实施方案
[0065] 在特定的实施方案中，分离的肤包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQID N0:1)ο
[0066] 在一些实施方案中，肤包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQIDNO: 2)，且 其中X是任何氨基酸。X可W是天然氨基酸或非天然氨基酸。
[0067] 在其他实施方案中，肤包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQIDNO: 2)，其 中X在位置7上是Μ、A或G;X在位置9上是F、A、Y或G;X在位置10上是Μ、A、G、dA或 Nle;X在位置11上是F、A、Y、G或4-ClI%e;X在位置12和位置18上是Abu、G、S、A、V、T、 I、L或AllyGly。在该实施方案中在X残基上的每个置换已被测试（如在国际PCT专利申 请公布号W0 2012/079088中所示，其通过引用W其整体并入本文，或在本文W下提供的实 施例中示出）或是测试的氨基酸的保守氨基酸置换。
[0068] 在一些实施方案中，本发明公开的肤具有数个X残基，其可W是任何氨基酸，无论 天然或非天然狂7、乂9^10^11^12和乂18)。就天然氨基酸而言，意指自然界中存在的那 些氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、鄉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬 酷胺、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酷胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半脫氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲 硫氨酸、脯氨酸、化咯赖氨酸和砸代半脫氨酸。就非天然氨基酸而言，意指自然界中不存在， 但可被渗入多肤链中的氨基酸。非天然氨基酸包括但不限于：2-氨基下酸（Abu)、