非天然发生因子h结合蛋白(fhbp)及其使用方法
【专利说明】非天然发生因子Η结合蛋白（FHBP)及其使用方法
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002 ]本申请要求2013年8月2日提交的、流水号61 /861，662的美国临时专利申请的优先 权，通过援引将该申请的公开内容完整收入本文。
[0003]关于联邦政府资助的研究的声明
[0004]本发明是在(美国）国家卫生研究院，国家变态反应和传染病研究所授予的基金的 资助下完成的，基金号R01AI099125-01。政府对本发明享有某些权利。
[0005] 导言
[0006] 脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)是一种革兰氏阴性细菌，寄居于人上 呼吸道，对最值得注意的脑膜炎和败血病的全球零星和周期性流行爆发负有责任。两岁W 下儿童中的感染和死亡率最高。与其它革兰氏阴性细菌相似，脑膜炎奈瑟氏菌典型地具有 细胞质膜、肤聚糖层、外膜和菌毛，外膜与芙膜多糖一起构成细菌壁，菌毛突出在外环境中。 有芙膜的脑膜炎奈瑟氏菌菌株是儿童和年轻成人中细菌性脑膜炎和败血症的一项主要原 因。侵入性脑膜炎奈瑟氏菌感染的流行上驱动了能赋予跨越不同菌株，特别是跨越具有不 同血清型或血清亚型的遗传多样性B群菌株的免疫力的有效疫苗的研究。
[0007] 因子Η结合蛋白（fHbp，在本领域也称作脂蛋白2086(Fletcheretal.(2004) InfectImmun72:2088-2100)、基因组衍生的奈瑟氏菌抗原（GNA)1870(Masi即anietal. (2003)JExpMed197:789-99)或"74Γ)是一种在脑膜炎奈瑟氏菌细菌中表达的表面暴露 的脂蛋白。??6ρ结合人补体因子H(fH)，其下调补体活化。fH对细菌表面的结合是病原体在 未免疫人血清或血液中存活及规避先天性宿主防御的一种重要机制。最近，发现人因子Η基 因簇的遗传变异影响发生脑膜炎球菌疾病的易感性（DavilaSetal.(2010)Nat Geneticsdoi: 10.1038/ng. 640)。甜对rabp的结合对于人巧是特异性的，而且能说明为什 么脑膜炎奈瑟氏菌严格地是人病原体。
[000引仍然需要能引发有效杀菌抗体应答的??6ρ多肤。
[0009] 发明概述
[0010] 提供了非天然发生因子Η结合蛋白及使用此类蛋白的方法，所述蛋白自变体3甜bp 衍生、能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体。
[0011] 在某些实施方案中，公开了自天然发生变体3甜bp衍生的非天然发生因子Η结合蛋 白（imp)。非天然发生imp可W包括选自精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸的氨 基酸对天然发生变体3??6ρ第223位组氨酸的替代，其中第223位的编号方式基于成熟巧bp ID1的编号方式。非天然发生甜bp可W具有比甜bpID79要低的对人因子Η(巧)的亲和力。
[0012] 在某些实施方案中，所述组氨酸可W用精氨酸替代。
[0013] 在某些情况中，所述变体3排bp可W是模块群Vfflbp。在其它情况中，所述变体 3??6ρ可W是模块群II??6ρ。
[0014] 例示性的非天然发生巧bp可W包括与巧bpID79的氨基酸序列具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列。
[0015]在某些情况中，非天然发生rabp可W包括带有氨基酸替代H223R的巧bpID28的 氨基酸序列。
[0016] 在某些情况中，非天然发生rabp可W包括带有氨基酸替代H223R的巧bpID67的 氨基酸序列。
[0017] 在某些情况中，非天然发生甜bp可W包括带有氨基酸替代肥23R的甜bpID175的 氨基酸序列。
[0018] 在某些情况中，非天然发生甜bp可W包括带有氨基酸替代H223R的巧bpID79的 氨基酸序列。
[0019] 在某些情况中，非天然发生rabp可W包括带有氨基酸替代H223R的巧bpID45的 氨基酸序列。
[0020] 在另一个实施方案中，提供了一种免疫原性组合物。免疫原性组合物可W包括:a) 本文中公开的非天然发生??6ρ;和b)药学可接受赋形剂。
[0021] 在某些情况中，非天然发生甜bp可W在自表达该非天然发生甜bp的脑膜炎奈瑟氏 菌菌株制备的囊泡制备物的表面上表达。
[0022] 在某些情况中，非天然发生??6ρ可W在免疫原性组合物中作为分离的多肤存在。
[0023] 在例示性的情况中，药学可接受赋形剂可W包括佐剂。
[0024] 在某些情况中，免疫原性组合物可W进一步包括别的脑膜炎奈瑟氏菌抗原。
[0025] 提供了一种在哺乳动物中引发针对脑膜炎奈瑟氏菌的抗体应答的方法。所述方法 可W设及对哺乳动物施用本文中公开的非天然发生??6ρ或本文中提供的免疫原性组合物。
[0026] 在某些情况中，所述施用提供针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体的生成。
[0027] 还公开了一种核酸，其编码本文中提供的非天然发生巧bp。本文中还提供了一种 重组表达载体，其包括编码非天然发生巧bp的核酸。例示性的实施方案包括一种经遗传修 饰的宿主细胞，其包括编码非天然发生甜bp的核酸或包括编码非天然发生甜bp的核酸的重 组表达载体。
[00%]本文中公开了另一种免疫原性组合物。此免疫原性组合物可W包括:a)自经遗传 修饰的奈瑟氏菌宿主细胞获得的囊泡，该宿主细胞经编码依照本公开文本的非天然发生 甜bp的核酸遗传修饰，使得该经遗传修饰的宿主细胞生成所编码的非天然发生巧bp，其中 该囊泡包括所编码的非天然发生??6ρ;和b)药学可接受赋形剂。
[0029] 在某些情况中，所述囊泡可W是天然外膜囊泡。
[0030] 在某些情况中，所述宿主细胞可W经遗传修饰W提供降低或缺无的IpxLl基因和/ 或lpxL2基因多肤产物活性。
[0031] 在例示性的实施方案中，所述宿主细胞经遗传修饰W提供升高的奈瑟氏菌抗原表 达。
[0032] 提供了一种在哺乳动物中引发针对奈瑟氏菌的抗体应答的方法。所述方法可W包 括对哺乳动物施用免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括:a)自经遗传修饰的奈瑟氏菌 宿主细胞获得的囊泡，该细胞经编码依照本公开文本的非天然发生??6ρ的核酸遗传修饰， 使得该经遗传修饰的宿主细胞生成所编码的非天然发生甜bp，其中该囊泡包括所编码的非 天然发生??6ρ;和b)药学可接受赋形剂。
[0033] 附图简述
[0034] 图USDS-聚丙締酷胺凝胶，指示重组??6ρID79野生型和突变体的大小和纯度。 道l，Benchmark梯状物（Invitrogen);道2，fHbpID79野生型；道3，fHbpID79H223R突变 体;道4,甜bpID79H223A突变体。在凝胶上加载化g每种重组巧bp。注意：氨基酸编号方式 基于成熟??6ρID1的编号方式。详情见实施例1。
[0035] 图2。人因子Η对甜bpID79突变体H223A和肥23R的结合，通过化ISA。小图A显示人 因子Η的结合。甜bpID79野生型(WT)，圆形符号；rabpID79H223A突变体，Ξ角形符号； rabpID79H223R突变体，星号符号。小图B显示对照单抗JAR11的结合。注意：氨基酸编号 方式基于成熟??6ρID1的编号方式。详情见实施例2。
[0036] 图3。人因子Η对甜bpID22突变体T221A和肥23A的结合，通过化ISA。小图A显示人 因子Η的结合。甜bpID22野生型(WT)，圆形符号;甜bpID22T221A突变体，星号符号;甜bp ID22肥23A突变体，Ξ角形符号。小图B显示对照单抗JAR13的结合。注意:Τ221和肥23的编 号方式基于成熟??6ρID1的编号方式。详情见实施例3。
[0037]图4。成熟fHbpIDUfHbpID22、fHbpID79、和fHbpID28的氨基酸序列的比 对。肥23W箭指示。
[003引图5。成熟v.3fmp的氨基酸序列的比对。肥23W箭指示。
[0039] 图6η??6ρ模块群I-IX的示意图。
[0040] 图7。显示小鼠对fflbpID79疫苗的杀菌应答的图。测试了甜bpID79野生型(WT) 和巧bpID79H223R突变体。对于巧bp疫苗，每个符号代表一份个体血清样品的滴度;对于 侣对照组，每个符号代表Ξ份血清样品的合并物的滴度。水平线代表每个组的几何均值滴 度。
[0041] 在描述本发明和本发明的特定例示性实施方案之前，要理解，本发明不限于所描 述的特定实施方式，因为它们当然可W有变化。还要理解，本文中使用的术语仅用于描述特 定实施方案的目的，而非意图是限制性的，因为本发明的范围仅会由所附权利要求限制。
[0042]在提供一个数值范围的情况中，应理解为本发明内涵盖该范围的上限和下限之间 的每个居间数值(差值为下限的单位的十分之一，除非上下文另有明示)及该所描述的范围 中的任何其它所描述的或居间的数值。运些较小范围的上限和下限可W独立包括在该较小 范围中，运也涵盖在本发明内，服从在所描述的范围中任何具体排除的限度。在所描述的范 围包括两个限度之一或二者时，本发明中还包括排除了那些所包括的限度之一或二者的范 围。
[0043]要领会，为清楚起见在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可 W在单个实施方案中组合提供。相反，为简要起见在单个实施方案的上下文中描述的本发 明的多个特征也可W分开或W任何合适子组合提供。本发明具体涵盖且本文中公开了相对 于参照氨基酸序列设及氨基酸修饰(包括氨基酸替代)的实施方案的所有组合，就好像每一 个组合均单独地和明确地公开，到达此类组合涵盖具有期望特征的多肤，例如所具有的对 人巧的亲和力比天然发生甜bp要低的非天然发生巧bp多肤。此外，本发明还具体涵盖且本 文中公开了描述此类氨基酸修饰的实施方案中列出的此类氨基酸修饰(包括氨基酸替代） 的所有子组合，就好像此类氨基酸修饰的每一个此类子组合单独地和明确地在本文中公 开。
[0044]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技 术人员的共同理解相同的含义。通过援引将本文中提到的所有出版物收入本文，用于公开 和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
[0045]必须注意，如本文和所附权利要求书中使用的，单数形式"一个"、"一种"、和"所 述/该"包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提到"一个/种抗原"包括多 个/种此类抗原，提到"所述/该蛋白"包括提到一个/种或多个/种蛋白，等等。
[0046]提供本文中讨论的出版物仅仅是因为它们在本申请的申请日之前公开。本文中无 一内容要解释为承认本发明不能通过发明在先而早于此类出版物。此外，所提供的出版日 期可能不同于实际的公开日期，可能需要独立确认。
[0047] 发明详述
[0048]如上所述，提供了能引发针对至少一种脑膜炎奈瑟氏菌菌株的杀菌性抗体的自变 体3??6ρ衍生的非天然发生因子Η结合蛋白及使用此类蛋白的方法。
[0049]
[(Κ)加]。因子Η结合蛋白"（fHbp)，在文献中也称作6酷1870、6臟1870、03。2086、口^2086(月旨 蛋白2086)、和"74Γ，指一类脑膜炎奈瑟氏菌多肤。甜bp在自然界中是作为在脑膜炎奈瑟氏 菌菌株的表面上表达的脂蛋白找到的。基于氨基酸序列可变性和免疫学交叉反应性 (Masi即anietal.(2003)JExpMed197:789-99)^冊9已经被细分成^个甜69变体群 (在一些报告(Masi即anietal.(2003)JExpMed197:789-99)中称作变体l(v.l)、变体2 (V.2)和变体（V.3)，在其它报告（参见例如Fletcheretal.(2004)InfectImmun72: 2088-2100))中称作家族A和B)。依照neisseria,org或pubmlst.org/neisseria/fHbp/网 站，还给在脑膜炎奈瑟氏菌中找到的每个独特甜bp指派甜bp肤ID。因为变体2(v.2)巧bp蛋 白（来自菌株8047，fHbpID77)和变体3(v.3)甜BP(来自菌株M1239，fHbpID28)的长度与 MC58(甜bpID1)的长度分别相差-1和巧个氨基酸残基，所W用于提到V.2和v.3ffibp蛋白 的残基的编号方式不同于基于运些蛋白的实际氨基酸序列的编号方式。
[0051]术语"异源"或"嵌合"指由自不同来源或祖先序列衍生的结构定义的两个成分。例 如，在嵌合多肤的语境中使用"异源"时，嵌合多肤可W包括可操作连接的氨基酸序列，它们 可W衍生自不同系统发生群的不同多肤(例如，来自α祖先氨基酸序列的第一成分和来自0 祖先氨基酸序列的第二成分）。含有两个或更多个限定区段，每个区段来自不同祖先的嵌合 多肤可W是天然发生的或人造的（非天然发生的）。关于天然发生嵌合体的更多详情参见 BeerninkPT，GranoffDM(2009)Microbiology155:2873-83。非天然发生嵌合体指。人造 嵌合体"，而且涵盖带有自然界中没有找到的异源成分的??6ρ。
[0052] "异源"或"嵌合"多肤还可W含有两个或更多个不同成分，每个衍生自不同巧bp (例如变体1、2、或3)。各成分可W在沿着??6ρ多肤长度的任何位置处可操作连接。
[0053]在编码上文所述任何嵌合多肤的多核巧酸的上下文中，"异源"可W包括自不同基 因（例如，来自编码甜bpV. 1多肤的核酸的第一成分和来自编码巧bpV. 2多肤的核酸的第 二成分)或不同祖先氨基酸序列(α或0)衍生的可操作连接的核酸序列。
[0054]其它例示性"异源"核酸包括表达构建体，其中包含编码序列的核酸可操作连接调 节元件(例如启动子），所述调节元件来自与编码序列的遗传来源不同的遗传来源(例如，为 了提供感兴趣宿主细胞中的表达，所述感兴趣宿主细胞的遗传来源相对于于启动子、编码 序列或二者可能是不同的）。例如，可操作连接编码甜bp多肤或其结构域的多核巧酸的Τ7启 动子被说成是异源核酸。
[0055]在重组细胞的语境中，"异源"可W指宿主细胞中存在与之遗传来源不同的核酸 (或基因产物，诸如多肤）。例如，一种菌株的奈瑟氏菌氨基酸或核酸序列对于另一菌株的奈 瑟氏菌宿主是异源的。
[0056] 在氨基酸序列或多核巧酸序列的语境中（例如，"衍生自"imp变体3,例如甜bpID 79的氨基酸序列），"衍生自"旨在指示多肤或核酸所具有的序列基于参照多肤或核酸(例如 天然发生甜bp蛋白或编码核酸）的序列，而且不旨在限制生成蛋白质或核酸的来源或方法。 衍生氨基酸序列或多核巧酸序列的参照多肤和参照多核巧酸的非限制性例子包括天然发 生巧bp，例如甜bpID79,和非天然发生巧bp。在细菌菌株的语境中，"衍生自"旨在指示通 过亲本菌株的体内传代或体外培养而获得的菌株，和/或通过修饰亲本菌株而获得的重组 细胞。
[0057]"保守性氨基酸替代"指一个氨基酸残基被共享氨基酸侧链的化学和物理特性(例 如电荷、大小、疏水性/亲水性)的另一氨基酸替代。"保守性替代"意图包括下述氨基酸残基 组内的替代：邑ly、ala;val、ile、leu;asp、邑lu;asn、邑ln;ser、thr;lys、ar邑；和phe、tyr。可? 自呈递感兴趣表位的多肤的氨基酸序列的比对得出关于此类替代的指导。
[0058]术语"保护性免疫"表示施用于哺乳动物的疫苗或免疫日程表诱导阻止、延迟由脑 膜炎奈瑟氏菌引起的疾病发生、或降低所述疾病的严重程度、或减轻或一并消除所述疾病 的症状的免疫应答。保护性免疫可W伴有杀菌性抗体的生成。应当注意的是，本领域中公 认，针对脑膜炎奈瑟氏菌的杀菌性抗体的生成预示着疫苗在人中的保护作用 (Goldschneideretal.(1969)J.Exp.Med.129:1307；Borrowetal.(2001)Infect Immun.69:1568)。
[0059]短语"由脑膜炎奈瑟氏菌菌株引起的疾病"涵盖人感染脑膜炎奈瑟氏菌中存在的 任何临床症状或临床症状组合。运些症状包括但不限于:脑膜炎奈瑟氏菌致病株寄居上呼 吸道(例如鼻咽和扁桃体粘膜）、细菌渗透入粘膜和粘膜下血管床、败血症、败血性休克、炎 症、出血性皮肤损伤、纤维蛋白溶解和血液凝结的激活、器官功能障碍(诸如肾、肺、和屯、力 衰竭）、肾上腺出血和肌肉梗死形成、毛细管渗漏、水肿、外周肢体缺血、呼吸窘迫综合征、屯、 包炎和脑膜炎。
[0060] 在抗原（例如多肤抗原）的语境中，短语"与抗体特异性结合"或"特异性免疫反应 性的"指基于和/或检验可能还包括其它分子的异质群的样品中抗原的存在情况的结合反 应。如此，在指定条件下，一种或多种规定抗体与样品中的一种或多种特定抗原结合，且不 W显著量与样品中存在的其它分子结合。在抗原的表位(例如多肤的表位)的语境中，"与抗 体特异性结合"或"特异性免疫反应性的"指基于和/或检验可能还包括其它表位的异质群 的抗原(例如多肤）W及抗原的异质群中表位的存在情况的结合反应。如此，在指定条件下， 一种或多种规定抗体与抗原中的一个特定表位结合，且不W显著量与抗原和/或样品中存 在的其它表位结合。
[0061] 短语足W引发免疫应答的量"表示在施用特定抗原制备物之前和之后测定的 免疫应答指标之间有检测得到的差异。免疫应答指标包括但不限于:抗体滴度或特异性，如 通过诸如酶联免疫测定法化LISA)、杀菌测定法、流式细胞术、免疫沉淀、Ouchterlony免疫 扩散等测定法检测的;结合检测测定法，例如点、Western印迹或抗原阵列的;细胞毒性测定 法等。
[0062]"表面抗原"是脑膜炎奈瑟氏菌的表面结构(例如外膜、芙膜、菌毛、等）中