钙整合素结合蛋白1在防治肠道病毒71型感染中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。
【背景技术】
[0002] 肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属人肠道 A类病毒，是导致手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。目前，手 足口病在世界多个地区暴发并流行，尤其是亚太地区。在我国，自2008年几大省市暴发手足 口病疫情以来，该病的感染人数和死亡率一直居高不下，每年报告发病数超过100万例，死 亡数近1000例。手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿，临床表现为发热，手、足、臀部以 及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状；少数患儿可发展为重症患者，出现中枢神经系统 (central nervous system，CNS)病变，包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脑脊髓炎以及神经源 性肺水肿等，严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T，Lewthwaite P，Perera D,Cardosa MJ，McMinn PjOoi ΜΗ.Viro logy,epidemiology,pathogenesis,and control of enterovirus 71.Lancet Infect 013.2010?^0￥;10(11):778-90.]。手足口病特别是重症病 例多由肠道病毒71型(EV71)感染所致。然而，目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异 高效的抗病毒药物，临床上仍以对症治疗为主，在预防方面也无有效疫苗问世。
[0003] EV71感染具有嗜神经性，易造成严重的CNS疾病及其并发症，这也是导致手足口病 患者发展为重症甚至死亡的主要原因。其中，脑干是最易被EV71感染的部位[Tee，K.K.，et al.Evolutionary genetics of human enterovirus 71:origin,population dynamics, natural selection,and seasonal periodicity of the VPlgene·J Virol，2010·84(7): p.3339-50.]，研究证实在EV71重症患者的脑干神经元等部位均能够检测到EV71基因及抗 原的存在，证明EV71能进入CNS。但EV71引起的中枢神经系统症状的机制尚不明确[Solomon T jLewthwaite PjPerera DjCardosa MJjMcminn PjOoi ΜΗ.Virology,epidemiology, pathogenesis，and control of enterovirus 71. Lancet Infect Dis.2010；10；778-90.]。神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)为神经组织来源，具有一定的神经细胞特性。因此，探明 EV71感染SH-SY5Y的机制并以此寻找新的抗病毒靶点，对于防治EV71所导致的中枢神经系 统感染至关重要。
[0004] 为了有效地感染细胞，病毒必须利用宿主细胞的膜分子及其囊泡运输系统完成对 宿主细胞的入侵，才能在细胞内进行复制并释放出有感染性的子代病毒颗粒。因此，作为病 毒感染宿主细胞的首要环节，细胞入侵已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。研究表明，EV71 可利用不同的宿主因子和感染途径来入侵不同种类的靶细胞，比如EV71感染Jurkat T淋巴 细胞系主要利用小窝依赖的内吞途径（caveolar-dependent endocytosis) [Lin HY，Yang YT,Yu SL,et al.Caveolar endocytosis is required for human PSGL-I-mediated enterovirus 71 infection · J Virol · 2013，87( 16): 9064-76 ·]。目前，关于EV71 感染SH-SY5Y的途径及机制仍不清楚。
[0005] 病毒侵入靶细胞主要借助了参与宿主细胞自身物质运输的关键分子，这些宿主细 胞膜转运分子在细胞的跨膜物质运输，囊泡的形成、内吞以及分泌中发挥着重要的作用。如 金属蛋白酶调节了细胞粘附，细胞膜分子的降解;小窝蛋白家族分子caveolin-1 (CAVl)、 〇已￥6〇1;[11-2(^￥2)、03￥601;[11-3(^￥3)将物质运输至高尔基体;？101:;[11;[11分子能够与脂後 内蛋白分子相互作用并内吞入细胞内；f丐整合素结合蛋白l(calcium-and inte-grin-binding protein，CIBl)通过调节微管的运动参与细胞的有丝分裂和轴突的形成;GTP酶激 活蛋白分子GRAFl在网格蛋白非依赖型的囊泡运输中具有重要的调节作用；白细胞介素2受 体内吞调节了信号通路并影响了细胞增殖(Jason Mercer ,Mario Schelhaas，et al. Virus Entry by Endocytosis.Annu Rev Biochem.2010;79:803-833.)^21^11 蛋白可通过酪氨酸 激酶信号调节细胞微管系统，继而调节了细胞黏附与迀徙等生理过程;Ezrin蛋白也被证实 参与了丙型肝炎病毒感染肝细胞的过程（Bukong TN，Kodys K，Szabo G.Human ezrin-moesin-radixin proteins modulate hepatitis C virus infection.Hepatology.2013, 58(5): 1569-79 ·)。外被蛋白复合体 COPA (coatomer protein comp I ex)参与 了小泡介导非 选择性运输，它参与从内质网到顺面高尔基体的运输。在这些分子中，caveolin-1被证实参 与了EV71感染Jurkat T淋巴细胞的过程，而其它分子在EV71感染中的作用还未有报道。 [0006] |丐整合素结合蛋白（calcium-and integrin-binding protein，CIB)是近年来新 发现的一类钙结合蛋白，在哺乳类动物组织中广泛分布。参与了细胞内的细胞内Ca2+稳态的 调节、细胞信号的转导、细胞增殖、细胞凋亡等功能。Kostyak等研究证实CIBl通过调节微管 的运动从而抑制细胞的增殖。（Kostyak JC，Naik UP.Calcium-and integrin-binding protein lregulates endomitosis and its interaction with Polo-like kinase3is enhanced in endomitotic Dami cells[J]PLoS 0ne，2011，6(l):el4513.)同时也有研究 证实CIBl通过抑制丝切蛋白活性，破坏细胞分裂时的收缩环完整性进而影响细胞周期。 Sobczak等对发育中的神经元进行研究，结果显示CIBl羧基端通过与SCGlO蛋白氨基端结 合，介导Ca2+信号转导，从而调节微管在轴突生长中的作用。（Sobczak A，Debowska K， Blazejczyk M,et al.Calmyrinlbinds to SCGlOprotein(stathmin2)to modulate neurite outgrowth[J].Biochim Biophys Acta,2011,1813(5):1025-1037.)
[0007] 目前还没有任何关于CIBl分子在EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)中作用的研 究报道，对于CIBl分子进行深入研究不仅能够提升对EV71感染与致病机制的认识，也可以 为预防与治疗EV71感染提供新的思路与靶点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点。
[0009] 本发明的另一目的在于提供钙整合素结合蛋白I(CIBl)分子的新用途，特别是在 抗肠道病毒71型感染中的应用。
[0010]本发明的第三目的在于提供干扰CIBl分子表达的siRNA。
[0011]本发明的主要技术方案是：
[0012]本发明，以人神经母细胞瘤（SH-SY5Y)作为靶细胞，采用RNA干扰技术下调靶细胞 宿主蛋白的表达，来寻找可有效抑制EV71感染人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)的宿主因子，从而 保护神经系统。本实验选择了一组宿主细胞跨膜转运分子来进行筛选，这些分子在宿主细 胞的跨膜物质运输，囊泡的内吞与分泌中发挥着重要作用，它们往往也是在病毒感染过程 中易被病毒"劫持"并利用的分子。这些分子包括:金属蛋白酶l〇(ADAM10)、钙整合素结合蛋 白 I(CIBl)、caveolin-1 (CAVl)、caveolin_2(CAV2)、caveolin_3(CAV3)、FlotilIin蛋白 1 (FLOTl)、GTP酶激活蛋白（GRAFl)、白细胞介素2受体（IL2RB)、Ezrin蛋白、外被蛋白复合体 (COPA)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件 对这些基因进行生物学分析，选择编码区作为SiRNA设计的靶序列，然后设计SiRNA，通过下 调这些分子，来观察对EV71感染的影响。
[0013] 我们发现钙整合素结合蛋白 I (calcium-and integrin-binding protein 1， CIBl)在EV71感染SH-SY5Y中发挥着重要的作用，下调CIBl的表达，能明显抑制EV71的感染。
[0014] 本发明的第一方面，提供了钙整合素结合蛋白I(CIBl)作为一种抗肠道病毒71型 感染的新靶点。
[0015] 所述的钙整合素结合蛋白 I(CIBl)，GENBANK ID:NM_006384。
[0016] 本发明的第二方面，提供了钙整合素结合蛋白I(CIBl)在制备预防或治疗肠道病 毒71型感染