一种量子点标记的生物体siRNA药物载体系统的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种药物载体，尤其是涉及一种量子点标记的生物体S iRNA药物载体。
【背景技术】
[0002]RNA干扰是一种细胞内源性的基因沉默机制，RNA干扰是一个有选择性的沉默机制，但是外源siRNA进入细胞的能力非常低，这对于它的理论治疗是一个障碍，如何设计有效的siRNA进入细胞的途径，对于治疗疾病是一个非常关键的因素。在siRNA进入细胞的途径中，传递载体必须有效的能够与核酸复合，并且有助于克服进入细胞的障碍，以及较小的细胞毒性等等。
[0003]目前，一系列的分子，包括脂质体，多肽等已经被证实了它们在传递DNA和RNA的有效性。成功的siRNA载体需要能够跟核酸复合，需要带有正电荷，含有高的缓冲能力，展示低的细胞毒性，并且含有能够被修饰的化学基团，或者修饰其它的分子基团。研究表明，阳离子脂质体DC-Chol/DOPE已经成功地用于DNA药物的体内传送。DC-Chol介导siRNA对Hela细胞的转染与商品化的转染试剂Iipofectamine 2000—样高效，毒性虽然较Iipofectamine2000小，但也是比较大的。使s iRNA进入细胞的方法，一种是传递编码s iRNA序列的DNA或者RNA的模板到细胞里面去，然后转入成siRNA。这些基于DNA-和RNA-编码序列的siRNA表达系统是通过质粒或者病毒携带进细胞的。另一种是直接携带siRNA进入细胞的方法。直接携带s iRNA进入细胞的方法中存在着相容性差，存在细胞毒性以及靶向性差的缺陷。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，开创性的将量子点PAMAM/HA/siRNA复合体系连接，增加了药物靶向位点的新方法，跟踪药物作用途径的新方法，其具有简化跟踪监测过程、降低了标记物对激光发射源的要求，同时跟踪多个作用革巴标点，实现药效革G点的跟踪，具有省时、尚效、灵敏度尚的优点。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供一种量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其包括一分子的PAMAM分子，该PAMAM分子上结合有一个含有21个碱基对的双链siRNA以及透明质酸分子形成PAMAM/HA/s iRNA复合体系；
[0006]所述PAMAM/HA/siRNA复合体系中的透明质酸分子还连接PEG(NH2)2分子，该PEG(NH2) 2与量子点连接形成量子点标记的生物体s i RNA药物载体系统。
[0007]所述量子点为CdSe量子点，所述CdSe量子点上带有羧基，所述CdSe量子点通过该羧基与PEG(NH2)2上的氨基连接。
[0008]所述透明质酸通过静电吸引的作用与所述PAMAM分子结合。
[0009 ] 所述透明质酸的电荷与所述PAMAM分子电荷比为0.4_0.6。
[0010]所述PAMAM溶解在pH为7的缓冲液中通过正负电荷之间的作用与双链siRNA连接。
[0011]所述PAMAM/HA/siRNA复合体系中，透明质酸的羧基被DCC和NHS活化后与PEG-(NH2)2 的一个氨基结合，得到(PAMAM/HA/s i RNA) -PEG-NH2。
[0012]所述量子点溶液经纯化后稀释于5 X 10—2磷酸纳缓冲液中，取适量(PAMAM/HA/siRNA)-PEG-NH2加入量子点溶液中，室温下搅拌反应0.2h，形成量子点标记的PAMAM/HA/s iRNA复合体系。
[0013]本发明具有以下有益技术效果:
[0014]本发明开创性的将量子点PAMAM/HA/siRNA复合体系连接，增加了药物靶向位点的新方法，跟踪药物作用途径的新方法，其根据不同的siRNA标记不同的量子点，由于量子点的尺寸、光谱特性各异，只需选用一种激发光源，就可以实现对不同性质的区域进行检测，从而大大简化了实际检测的过程，降低了对激光发射源的要求。同样的原理，量子点可以成为筛选siRNA、发现siRNA靶点在细胞位置的有力工具，并为药物作用机制的研究提供非常有价值的信息。通常，药物发生药效时，除了同靶分子结合外，还会与体内其他的一些分子结合，产生副作用，利用不同颜色荧光的量子点(或光谱编码微粒)，就可以高通量地、并行地研究与药物作用，包括靶分子在内的所有分子，省时、高效、灵敏度高。
【附图说明】
[0015]图1为本发明的PAMAM/HA/siRNA复合物体系的电镜照片图；
[0016]图2为本发明的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统电镜照片图。
【具体实施方式】
[0017]实施例1量子点的制备
[0018]采用TOPO作为有机配位溶剂，用Cd (CH3) 2和TOP-Se作为反应前驱物，依次将其注入到剧烈搅拌的350°CT0P0溶液中，在短时间内生成大量的CdSe纳米颗粒晶核，然后迅速降温至240°C以阻止纳米颗粒继续成核，随后升温到260°C_280°C并维持一段时间，根据其吸收光谱侧晶体生长，当晶体生长到所需的尺寸时，将反应液冷却至60°C。加入丁醇防止TOPO凝固，随后加入过量的甲醇，由于CdSe纳米颗粒不溶于甲醇，通过离心变可得到CdSe纳米颗粒，通过改变温度可以寄将粒径控制在2.4-13纳米之间。
[0019]本发明采用巯基乙酸或巯基乙胺作为稳定剂，直接在水溶液中合成了CdSe半导体量子点(量子产率为30%，量子产率是通过比较在激发波长下具有一致光学密度的纳米粒子溶液与罗丹明6G水溶液在480?850nm间的发射积分求得的)。
[0020]本发明不仅解决了半导体纳米粒子的水溶性问题，而且由于在纳米粒子的外面包覆了一层巯基乙酸或巯基乙胺，借助于其外端的功能基团，能与生物分子相结合，从而达到直接标记生物分子的目的。
[0021]实施例2 PAMAM分子与含有21个碱基对的双链siRNA的连接
[0022]本发明采用的乙二胺核的PAMAM，S卩PAMAM为酰胺亚胺表面，在PH=7左右的DPBS条件下带有正电荷。使其可与一些带有负电荷的粒子通过静电相互作用结合在一起，当然也可以通过化学键将末端的氨基与其它分子连接。
[0023]将PAMAM分子与含有21个碱基对的双链siRNA的连接的具体步骤如下:
[0024]步骤一:制备一定浓度的PAMAM
[0025]取30μ1含有1wt.%甲醇溶液于2ml的tube管中，在真空干燥箱中干燥1min左右，除去甲醇。计算PAMAM的质量:
[0026]步骤二:配制浓度为8μηιο I的s i RNA。
[0027]将一管新的干燥SiRNA(1D)离心大概lmin，然后加入150μ1的DEPC水，配置成浓度为20μ1的siRNA，取?ομ?的20μΜ的SiRNA到1.5ml的tube管中，用DEPC水稀释至体积为25μ1，此时siRNA的浓度为8μΜ。
[0028]步骤三:配制PAMAM/siRNA复合物体系
[0029]一分子(G4)的PAMAM分子表面在PH=6.8的DPBS中带有64个正电荷，一个含有21个碱基对的双链siRNA带有42个负电荷，由于正负电荷的静电相互作用，两者会结合在一起。
[0030]配制正负电荷比例为5的PAMAM/ s i RNA的复合物，正负电荷的数量比例，也