一种新型生物医用粘合剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种具有良好生物相容性、生物降解性和强粘合力，兼具填充、密封、止血功能的医用伤口粘合剂及其制备和使用方法，属于生物医用材料制备领域。
【背景技术】
[0002]多年来，临床上最常用的伤口缝合方法是采用缝合线、铆钉等材料或器械缝合，这种方法保证了拉伸强度，但是会增加病人痛苦、创面愈合后留有疤痕而且操作麻烦。随着现代医学的快速发展，临床上对伤口粘合的要求越来越高，不仅要求最大限度地减少患者伤痛，缩短愈合时间，而且要求在恢复功能的同时，外观也能完美地恢复。而组织粘合剂因具有粘合时间短、用法简单、可体内降解等优点，广泛地应用于临床。目前，在临床上使用最多的粘合剂有氰基丙烯酸酯衍生物、纤维蛋白胶和明胶-戊二醛衍生物类组织粘合剂，但这些粘合剂仍存在很多缺陷，如氰基丙烯酸酯衍生物虽粘合力大，但生物相容性差，纤维蛋白胶粘合力不足，并具有携带病毒的风险，明胶-戊二醛类粘合剂易产生细胞毒性反应。为了解决这些问题，人们开始对贻贝足丝具有强粘附力的原因进行研究，发现正是足丝蛋白中的一种酪氨酸衍生氨基酸L-3，4_ 二羟基苯丙氨酸(D0PA)赋予了贻贝在水下环境中仍具有超强粘附力的功能，进而发现与D0PA结构相似的多巴胺(L-3，4-二羟基苯丙氨)也具有在水相中粘附物体的性能，得到越来越多研究者的关注。
[0003]多巴胺结构中的儿茶酚基团与其粘附性能息息相关，通过多巴胺的氨基与材料的羧基酰胺化反应来接枝多巴胺，也可赋予材料优良的粘附性能，尤其在湿润环境中仍然具有强粘附力。大量研究证明，多巴胺具有良好的生物相容性，能够促进细胞粘附和增殖(Shin J, Lee JS, Lee C, Park H-J, Yang K, Jin Y, et al.Tissue AdhesiveCatechol-Modified Hyaluronic Acid Hydrogel for Effective, Minimally InvasiveCell Therapy.Advanced Funct1nal Materials 2015 ; 25:3814-24.)。已有一些以多巴胺为原料制备生物粘合剂的报道，如中国发明专利CN104623725A报道了使用多巴胺与丙烯酸酯和一些高分子物质接枝聚合制得的生物粘合剂;专利CN104056300A报道了使用多糖与多巴胺接枝构建的复合生物胶粘合剂。然而，前者采用了一些有机溶剂，这无疑增加了粘合剂的细胞毒性，后者构建的生物胶主要用于软骨损伤的修复，粘合强度不高。海藻酸钠和I型胶原都是天然生物质材料，具有良好的生物相容性和可生物降解性，均能促进组织愈合，同样受到广泛的研究和应用。经氧化制得的氧化海藻酸钠由于分子内含有活性基团醛基，可与组织的氨基发生席夫碱反应，从而产生粘合，但是其降解快，很少单独使用，往往是与其它材料复合制作粘合剂。如中国发明专利CN101716366A采用氧化海藻酸钠与明胶交联构建生物胶型止血剂，粘合强度高于纤维蛋白胶，但是在体内湿润环境下粘合强度仍达不到要求，而且明胶在生物活性、低免疫原性和促进伤口愈合方面远不及I型胶原突出。
[0004]因此，开发出一种生物相容性好，体内湿润环境下粘合强度高的医用组织粘合剂显得尤为必要，且需要尽可能满足如下条件:
1.使用安全、无毒、具有良好的生物相容性，不妨碍人体组织的自身愈合； 2.在生理条件下能够快速地粘合组织，具有良好的粘合强度和持久性；
3.兼具一定的止血和促进组织再生功能，并且能够抑制细菌感染；
4.在合理时间内可降解和被机体吸收，降解产物对机体无毒副作用；
5.使用方便，容易保存，价格低廉，原料易得。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有粘合剂生物相容性低、体内湿润环境粘合强度不足而提供的一种能够与伤口产生原位交联的生物医用粘合剂及其制备和使用方法，该粘合剂生物相容性好，可被机体完全降解吸收，体内湿润条件下粘合强度大，又兼具填充、密封和止血功能，同时可以促进组织愈合和修复，可作为一种医用组织粘合剂、密封剂或止血剂用于临床创伤修复。
[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
(1)氧化海藻酸钠的制备:称取10g海藻酸钠，分散于25?100mL无水乙醇中，再避光称取2?6g的高碘酸钠溶于25?100mL蒸馏水中，两者混合，在20?40°C条件下避光磁力搅拌反应2?10h，加入10?30mL乙二醇终止反应0.5?2h，最后用蒸馏水透析1?3天，将截留物在10000?20000rmp下离心10~30min，除去沉淀，将上清液在压力0?20Pa、温度-100~-30°C条件下冷冻干燥48?72h，即制得氧化海藻酸钠；
(2)多巴胺接枝氧化海藻酸钠溶液的制备:称取一定质量的氧化海藻酸钠，溶于MES缓冲液中，配成质量浓度为2%?10%的氧化海藻酸钠溶液;在氮气保护下，将一定质量比例的Ι-Ο-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 溶于上述氧化海藻酸钠溶液中，20?40°C下反应10?40min，再加入一定质量比例的多巴胺，20?40°C继续反应8?24h，制得多巴胺接枝氧化海藻酸钠中间体，装入截留分子量为3000?3500Da或8000?14000Da的透析袋中，用蒸馈水透析1?3天后，取截留液在压力0?20Pa、温度-100?-30°C条件下冷冻干燥48?72h，然后将冻干产物溶于PBS或硼酸钠溶液中，配成质量浓度为5%?20%的溶液，即得A液；
(3)1型胶原溶液的制备:将一定质量的I型胶原粉剂溶解在一定浓度的无机酸或有机酸溶液中，在4?20°C下搅拌使之完全溶解，然后用0.2?0.5mol/L的氢氧化钠溶液中和pH至5.0?8.0，最终配成浓度为5?15mg/mL的I型胶原溶液，即得B液；
(4)使用前首先用质量浓度为3%?30%的双氧水或酶活性单位为10?40U/mL的辣根过氧化物酶清洗伤口，然后将上述A、B两液按照1:1?2的体积比均匀混合后立即涂覆到伤口处，30?120s内即可形成凝胶，可牢固粘附于伤口表面。
[0007]进一步地，步骤(1)中所述的海藻酸钠粘均分子量为200~350kDa;氧化后的海藻酸钠糖醛基单元占海藻酸钠总糖醛酸单元的摩尔百分数为10%?70%。
[0008]步骤(2)中所述的MES缓冲溶液的pH为4.5-6.5，PBS缓冲液pH为7.0-8.0,硼酸钠溶液浓度为0.1-0.5mol/L，pH为7.0-8.0；所述氧化海藻酸钠与EDC和NHS的投料质量比为1.0:
0.8?3.0:0.2?1.0，氧化海藻酸钠与多巴胺投料质量比为1.0:0.3?1.0，产物中多巴胺接枝率为5%?40%。
[0009]步骤(3)中所述I型胶原粉剂来源于猪皮、牛皮、猪腱或牛腱之一种，分子量30万道尔顿以上，具有完整的三股螺旋结构，羟脯氨酸含量不小于总蛋白含量的9%(m/m)，溶解I型胶原时所用酸液为甲酸溶液、醋酸溶液、硫酸溶液或盐酸溶液之一种，酸液浓度为0.Ι-Ο.5mol/L。
[°01°] 步骤(4)中所述粘合剂涂覆到伤口的涂覆量为0.1?0.3mL/mm2。
[0011]本发明所得原位交联生物医用粘合剂满足以下关键性能指标:
外观:红褐色或红橙色，凝胶状物；
重金属含量:< 10yg/g(m/m)；
水蒸气透过率:37°C，35%相对湿度条件下粘合剂的水蒸气透过率为1000?2500g/m2.24h；
平衡溶胀率:<2g/g湿胶；
粘合力:猪皮搭接剪切强度不低于50kPa;
细胞毒性:细胞毒性反应不大于I级；
无菌试验:无菌；
致敏试验:无迟发型超敏反应；
皮内反应试验:原发性刺激指数PII <0.4。
[0012]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:(1)所制医用粘合剂具有良好的生物相容性和体内湿润环境下强粘附力，粘附效果优于临床上广泛使用的纤维蛋白胶；(2)溶胀率低，透水透气性良好，可使伤口保持湿润环境，能够促进细胞粘附、增殖和伤口愈合；
(3)可生物降解，降解产物能被机体完全吸收；(4)原位交联粘合时间短，效果好，也可作为密封剂或止血剂用于临床。
【具体实施方式】
[0013]下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0014]实施例1
(1)氧化海藻酸钠的制备:称取10g海藻酸钠，分散于25mL无水乙醇中，再避光称取2g的高碘酸钠溶于25mL蒸馏水中，两者混合，在20°C条件下避光磁力搅拌反应2h，加入10mL乙二醇终止反应0.5h，最后用蒸馏水透析1天，将截留物在lOOOOrmp下离心lOmin，除去沉淀，将上清液在压力OPa、温度-100°C条件下冷冻干燥48h，即制得氧化海藻酸钠；
(2)多巴胺接枝氧化海藻酸钠溶液的制备:称取一定质量的氧化海藻酸钠，溶于pH为4.5的MES缓冲液中，配成质量浓度为2%的氧化海藻酸钠溶液;在氮气保护下，将一定质量比例的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于上述氧化海藻酸钠溶液中，使得氧化海藻酸钠与H)C和NHS的投料质量比为1.0:0.8:0.2，20°C下反应lOmin，再加入一定质量比例的多巴胺，使得氧化海藻酸钠与多巴胺投料质量比为1:
0.3，20°C继续反应8