Tspan 33是用于治疗b细胞霍奇金淋巴瘤的抗体靶向疗法的候选物的制作方法
【专利说明】TSPAN 33是用于治疗B细胞霍奇金淋己瘤的抗体祀向疗法的 候选物
[0001] 关于联邦政府资助的研究或开发的声明
[0002] 本发明是在政府支持下根据美国国家卫生研究院（National Institutes of Health)的资助号R21 AI096278做出的。政府享有本发明的某些权利。
[000引背景
技术领域
[0004] 本发明设及在活化的B细胞中表达的蛋白质TSPAN33。
【背景技术】
[0005] B细胞是协调适应性免疫系统的体液反应的淋己细胞(1)。不同于在胸腺中成熟的 T细胞，B细胞在骨髓中产生，其中它们成熟而成为成熟的初始B细胞（1)。8细胞仅负责分泌 识别外来抗原的抗体或在自身免疫性疾病的情况下分泌自身抗原。抗体分为多种亚型，运 些亚型决定了它们的位置和功能运两者，如参与保护粘膜表面的IgA。某些类型的淋己瘤具 有B细胞起源。B细胞淋己瘤在历史上已经被分成两种主要的类型：霍奇金淋己瘤化Odgkin lymphoma, HL)和非霍奇金淋己瘤（NHL)。W托马斯霍奇金（Thomas Hodgkin)命名并且在 1832年被首次描述(2)的霍奇金氏淋己瘤的特征在于存在李-施二氏细胞(Reed Sternberg cell)、脾、淋己结或身体其他免疫组织的肿大，W及可W波及到淋己组织W外的异常生长。 术语'非霍奇金氏淋己瘤'已经被用于描述不伴有标志性化症状的所有类型的淋己瘤。现行 的淋己瘤分类已经将化或NHL分组体系替代为在4大类中含有80种类型的分组体系（2)。本 发明的一些实施方案设及使用在活化B细胞的膜或B细胞淋己瘤中表达的新颖生物标志物 来鉴定特定的病变B细胞或实现对表达也被称为BAAM抗原的四旋蛋白33 (TSPAN33)的病变B 细胞或T细胞淋己瘤的特异性消除，运是因为已知一些T细胞淋己瘤异常地表达B细胞抗原， 如CD20(3)。因此，使用BAAM作为治疗性祀标不受淋己瘤类型的限制，但是受到在淋己细胞 的表面上由TSPAN33/BAAM基因编码的蛋白质的存在所限制。
[0006] 癌症免疫疗法已经由于治疗性单克隆抗体的发展而发生转变。运些抗体祀向在肿 瘤细胞中特异性表达的细胞表面分子。存在允许同时对数千种基因的表达进行集体筛选的 技术，如基因阵列。生物信息学的应用允许对基因阵列数据进行分析W鉴定编码细胞表面 蛋白的基因，运些细胞表面蛋白代表了用于研发单克隆抗体的祀标。然后运些抗体可W被 用作治疗剂W减缓肿瘤生长或直接杀灭肿瘤细胞。抗体祀向疗法已经日益普及，运是因为 保罗?欧立希(Paul化rlich)最初在1908年将抗体设想为可W向微生物或肿瘤递送毒素 的"魔术弹(magic bullet)" (4)。在1981年，Gaf far ,S.A.等（5)使用针对人类癌胚抗原 (CEA)的放射性标记的抗体W可能经由诱导DNA损伤来向人类结肠癌异种移植物递送特异 性细胞毒性。在1988年，DeNardo等(6)报道了 10名患有B细胞恶性肿瘤的患者中有4名在接 受放射性标记的抗体祀向疗法的施用后完全或部分缓解。不久之后，其他人已经报道了 "裸"（未标记的)抗体经由补体介导的细胞毒性(CMC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的类似 的抗肿瘤活性(7)。
[0007] 治疗性抗体与祀分子结合可W触发通常由该祀分子控制的信号转导通路。运可W 弓植肿瘤细胞命运的改变。它可W引起细胞调亡、坏死、细胞周期停滞、增强的增殖、或分 化。运些发生改变的细胞行为中的一些在癌细胞的情况下是理想的，特别是引起细胞死亡 或增殖停滞的那些(坏死、细胞调亡）。本领域技术人员可W确定给定的抗体是否在肿瘤细 胞中诱导运些效应中的任一种(8-9)。
[0008] 由小鼠细胞产生的单克隆抗体需要'人源化' W降低它们的免疫原性W用于人类 中。存在多种实现运样的方式。一种是通过产生人源化抗体，其中抗体的小鼠区域(可结晶 片段或化)被人类化序列置换(9)。运可W使用多种分子生物学技术来完成(8-9)。或者，可 通过对转基因小鼠进行免疫接种来产生抗体，所述转基因小鼠的免疫系统已经通过使用分 子生物学技术用人类免疫球蛋白基因置换小鼠免疫球蛋白基因而被改变。已经产生了多种 运样的小鼠（7)。
[0009] 鉴于上述可能性，治疗性单克隆抗体已经变成治疗各种癌症的优选方法（10)。基 于FDA批准的抗体的疗法，如利妥昔单抗(rituximabK-种抗CD20抗体)已经被用于治疗非 霍奇金氏淋己瘤(NHL) W及自身免疫性病症，如类风湿性关节炎(RA)(Il)D因此，针对在疾 病细胞/组织上表达的独特的生物标志物的抗体祀向疗法已经被证实有效治疗人类癌症或 自身免疫性病症。其他实例包括赫赛汀化erceptin)，即一种祀向乳腺癌细胞中的化r-2抗 原的人源化单克隆抗体（12);或阿瓦斯汀(Avastin),即一种祀向结肠直肠癌的血管内皮生 长因子的人源化抗体(13)。运些实例代表了在某些人类癌症中具有显著的（积极的）治疗作 用的非常成功的抗体。
[0010] 祀向B细胞的抗体已经被证实在治疗上是重要的，运是因为许多淋己瘤和白血病 表达B细胞抗原（11)。一个实例是利妥昔单抗（14)，即一种祀向CD20的治疗性抗体，所述 CD20是在某些人类淋己瘤中表达的蛋白质。然而，正常的B细胞也表达CD20,因此尽管祀向 CD20的抗体疗法消除了大部分的肿瘤细胞，但是运种治疗也除去了它们也表达CD20的正常 B细胞（15)。运是在人类中施用利妥昔单抗的严重副作用。尽管如此，消除肿瘤细胞的益处 仍证明在患有CD20阳性淋己瘤的患者中使用利妥昔单抗是合理的（11)。
【发明内容】
[0011] 在一个方面，提供了一种治疗其中TSPAN33上调的淋己瘤或白血病的方法。所述方 法包括向需要运种治疗的患者施用有效治疗淋己瘤或白血病的量的抗TSPAN33抗体。
[001引在所述方法中：
[0013] a)所述淋己瘤可为霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、前体T细胞白血病/淋己瘤、滤 泡性淋己瘤、弥漫性大B细胞淋己瘤、套细胞淋己瘤、B细胞慢性淋己细胞性白血病/淋己瘤、 MALT淋己瘤、伯基特氏淋己瘤(Burkitt'S lymphoma)、伯基特氏淋己瘤、非特指性外周T细 胞淋己瘤（peripheral T-cell Iymphoma-Not-Otherwise-Specifie d)、霍奇金淋己瘤的 结节硬化形式、或霍奇金淋己瘤的混合细胞亚型；
[0014] b)所述淋己瘤可为霍奇金淋己瘤或非霍奇金淋己瘤；
[0015] C)所述施用可W引起患者的TSPAN33+B细胞的数目减少；
[0016] d)所述抗TSPAN33抗体可为单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合;或
[0017] e)a-d 的组合。
[0018] 在另一个方面，提供了 一种治疗其中TSPAN33上调的免疫性疾病的方法。所述方法 包括向需要运种治疗的患者施用有效治疗免疫性疾病的量的抗TSPAN33抗体。
[0019] 在所述方法中：
[0020] a)所述免疫性疾病可为过敏或自身免疫性疾病；
[0021 ] b)所述疾病可为类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、舍格伦综合征(Sjogren'S syndrome)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃瘍性结肠炎、克罗恩氏病（Crohn's disease)、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎化ashimoto thyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减 少性紫齋、混合型结缔组织病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天瘤疮、颠动脉炎、白斑病、 或全身性红斑狼疮；
[0022] C)所述疾病可为类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮；
[0023] d)所述施用可W引起患者的TSPAN33+B细胞的数目减少；
[0024] e)所述抗TSPAN33抗体可为单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合;或 [00巧]f)a-e的任何组合。
[0026] 在另一个方面，提供了一种将活化的B淋己细胞纯化的方法。所述方法包括将抗 TSPAN33抗体与含有淋己细胞的细胞制备物混合，W及分离由所述抗体结合的淋己细胞。在 所述方法中，所述抗TSPAN33抗体可为单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合;和/ 或所述分离可通过巧光活化细胞分选来进行。
[0027] 在另一个方面，提供了一种鉴定活化和/或病变的B淋己细胞的方法。所述方法包 括检测淋己细胞中TSPAN33的表达上调。
[002引在所述方法中：
[0029] a)所述检测可W包括:将抗TSPAN33抗体添加到包含所述淋己细胞的蛋白质的样 品中；当在所述样品中存在TSPAN33时所述抗体与TSPAN33之间形成免疫复合物；W及检测 所述免疫复合物；
[0030] b)所述检测可W包括：由所述淋己细胞的RNA制备CDNA;使用对TSPAN33基因中的 核巧酸序列具有特异性的引物扩增所述CDNA，或使所述CDNA与TSPAN33基因的核巧酸序列 杂交；W及检测所述扩增反应的扩增产物或检测所述CDNA与TSPAN33核巧酸序列之间的杂 交体；
[0031] C)所述淋己细胞可W来自于患者，并且所述方法还可W包括当检测到TSPAN33的 表达上调时向所述患者施用抗TSPAN33抗体;或
[0032] d)a)和C)、或b)和C)的任何组合。
[0033] 在另一个方面，提供了一种对设及活化和/或病变的B淋己细胞的淋己瘤或免疫性 疾病进行诊断的方法。所述方法包括针对活化和/或病变的B淋己细胞的存在分析患者的样 品，运是通过检测所述样品的淋己细胞中TSPAN33的表达上调来进行，当检测到活化和/或 病变的B淋己细胞时，将所述患者诊断为患有所述淋己瘤或免疫性疾病。
[0034] 在所述方法中：
[0035] a)所述疾病可为霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、前体T细胞白血病/淋己瘤、滤泡 性淋己瘤、弥漫性大B细胞淋己瘤、套细胞淋己瘤、B细胞慢性淋己细胞性白血病/淋己瘤、 MALT淋己瘤、伯基特氏淋己瘤、伯基特氏淋己瘤、非特指性外周T细胞淋己瘤、霍奇金淋己瘤 的结节硬化形式、或霍奇金淋己瘤的混合细胞亚型；
[0036] b)所述疾病可为类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、舍格伦综合征、自身免疫 性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃瘍性结肠炎、克罗恩氏病、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫 性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减少性 紫齋、混合型结缔组织病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天瘤疮、颠动脉炎、白斑病、或全 身性红斑狼疮；
[0037] C)所述疾病可为霍奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤、类风湿性关节炎或全身性红斑 狼疮；
[0038] d)检测所述样品的淋己细胞中TSPAN33的表达上调可通过本文所述的检测 TSPAN33表达上调的任何方法来进行。
【附图说明】
[0039] 为了更完全了解本发明，现在结合附图参考W下说明，在附图中：
[0040] 图1是人类TSPAN33的氨基酸序列（SEQ ID N0:1)。
[0041 ]图2是人类TSPAN33(SEQIDN0:1)和小鼠 TSPAN33(SEQIDN0:2)的氨基酸序列 比较。还示出了共有序列（SEQ ID N0:3)。
[0042] 图3是示出了在正常人类组织中TSPAN33表达限于活化的B细胞的图表。由基因表 达的人体指数化uman body index)数据库汇编的Affymetrix基因阵列化133 plus 2.0)数 据观测到TSPAN33在正常的人类组织(n = 8)和免疫细胞中的表达。X轴由器官系统构成:CNS (中枢神经系统）、Gut(胃肠系统）、Struct(结构系统）、Vasc(脉管系统）、Resp(呼吸系统）、 Endo(内分泌系统）、Ur(泌尿系统）、Rep(生殖系统）、Imm_T(免疫组织）、Imm_C(免疫细胞）、 W及Dev(发育系统）。
[0043] 图4是示出了在小鼠和人类中TSPAN33表达限于活化的B细胞的图。4A)与人类骨髓 相比，由人类血液纯化的休止的和活化的（抗CD40+化-4)人类B淋己细胞中TSPAN33表达的 qRT-PCR(n = 3)D4B)使用肌动蛋白作为上样对照，在休止状态和活化状态(使用CpG+美洲商 陆有丝分裂原(PWM)+pansorbin)下PBMC的TSPAN33表达的蛋白质印迹。还示出了光密度分 析。4C)在人类沈2 B细胞（黑色条柱）中在抗CD40 mAb+IL-4刺激下W及在人类化rkat T细 胞（白色条柱）中在未刺激、抗CD3+抗CD28 mAb、或PMA+离子霉素（ionomyCin)刺激下在12小 时内随时间推移TSPAN33表达的9削斗〔3，11 = 3。40)休止的人类262 6细胞相比于使用抗 CD40mAb+IL-4活化的人类沈2 B细胞中TSPAN33表达的蛋白质印迹。还示出了光密度分析。 4E)在休止状态W及使用0.1、1或10 ng/mL的LPS+比-4的活化状态下Tspan33 A20-2J B细 胞的qRT-PCRd4F)由C57BL/6脾脏富集的休止的B细胞或被刺激(使用10 ng/mL的LPS+a-4) 12小时的B细胞的qRT-PCR，n = 3，*p<0.05，林p<0.01 W及***p<0.001表示根据斯氏t检 验（Student's t test)具有统计显著性。数据代表S次独立实验。误差棒表示标准偏差 (SD)。
[0044] 图5是示出了 TSPAN33在人类霍奇金氏淋己瘤和非霍奇金氏淋己瘤中表达的图。 5A)对多种人类NHL细胞系进行qRT-PCR并且测量TSPAN33(黑色条柱)相比于MS4A1/CD20(白 色条柱)表达。针对GAPD聞尋样品归一化。5B)与GAPDH相比，在人类伯基特氏淋己瘤细胞系 尺曰扣、3曰111〇3^及化11山中相对于在8曰。3(-种小鼠祖8细胞系）中对应于15口4肥3的大细胞外 环区33 (LEL)的RT-PCR表达分析。5C)使用兔抗TSPAN33多克隆抗体对Ra j i、Ramo S、Daud i、W 及BaF3细胞的TSPAN33表达进行的蛋白质印迹分析。数据代表S次独立实验。
[004引图6是示出了 TSPAN33在人类淋己瘤中表达的一组图像。将淋己瘤活检切片并且使 用苏木精/伊红和抗TSPAN33抗体染色，继而使用同种型或抗兔IgG-HRP染色。白色箭头指示 李-施二氏细胞并且黑色箭头指示TSPAN33染色呈阳性的细胞。取自被诊断患有化(n = 6)、 DLB化(n = 6) W及套细胞淋己瘤(n = 2)的患者的活检的代表性图像。
[0046] 图7是示出了 TSPAN33在B细胞相关的自身免疫中上调的图。7A)针对CD19表达归一 化的取自MRL/hslpVlpr小鼠的总脾细胞的Tspan33表达的qRT-PCR。比较9周大(无可检测 出的病变）、24周大(伴有或不伴有轻度耳部病变的淋己结病）W及36周大(伴有耳部和面部 病变的淋己结病）的小鼠的139曰1133表达，11 = 5。78)来自11.5周大的雌性(淋己结病)和12.5 周大的雄性（无病变)MRL/faslpr/lpr小鼠的CD19+CD138-和CD19-CD138+脾细胞中Tspan33 表达的qRT-PCR，n = 2。7C)对来自人类化E患者或健康对照的PBMC进行的TSPAN33表达分析 的qRT-PCR，n = 9D7D)对来自健康人和RA患者的滑膜中TSPAN33表达相比于MS4A1/CD20表达 的微阵列分析。如所述化.Soto ,P.胎vezi ,R. B.Roth ,A. Pahuja,D. Alleva,H.M. Acosta, C.Martinez ,A.Ortega,A.Lopez,R.Araiza-Casillas,A.Zlotnik,Gene array analysis comparison between rat collagen-induced arthritis and human rheumatoid arthritis，Scand J Immunol ,68(2008)43-57)，从对照或RA患者分离滑膜。将RNA从膜中分 离并且使用Affymetrix基因阵列U133 plus 2.0分析MS4A1/CD20和TSPAN33表达，健康人的 n = 9并且RA患者的n = 5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(斯氏t检验）。数据代表至少S 次独立实验(A-C)。误差棒表示标准偏差(SD)。
[0047] 图8是示出了 TSPAN33在近曲小管、远曲小管W及集合管中表达，但不在肾脏肾小 球中表达的一组图像。对肾脏活检进行染色W在组织阵列中进行IHC。将样品用苏木精/伊 红和抗TSPAN33或兔IgG同种型对照染色，继而用抗兔IgG-HRP染色。8A)示出了淋己细胞(黑 色箭头）和神经（白色箭头）的40倍放大图。8B)示出了近曲小管（黑色箭头）和肾脏肾小球 (白色箭头）的40倍放大图。8C)示出了远曲小管（黑色箭头)和集合管（白色箭头）的40倍放 大图。8D)示出了顶面(黑色箭头)和颗粒（白色箭头)的近曲小管的100倍放大图。
【具体实施方式】
[0048] 要求2012年12月21日提交的美国临时申请号61/740，946的优先权，该临时申请于 W引用的方式并入本文。
[0049] 四旋蛋白33是膜蛋白的四旋蛋白家族的成员（16)并且被定位到人类染色体7 (7q31.2-q32) (17)，即为骨髓发育异常综合征和急性骨髓性白血病中缺失的热点的区域 (17)。四旋蛋白33最初被表征为设及红细胞生成的新四旋蛋白（17-18)。
[0050] 四旋蛋白33还被命名为Penumbra,即Pen(17)(对于原成红细胞 (町〇斟Tthrob 1 ast)些(新)膜(membrane ))，运是因为带有化n基因祀向缺失的小鼠（Perf/-) /%^半有贫血和脾品去的异常^夫品嗜碱性1?(：(18)。在小鼠的骨髓中，在包括所有的成红 细胞的TER119+部分当中发现最高的化numbra表达，而在中性粒细胞、休止的T细胞、休止的 B细胞、单核细胞、或自然杀伤细胞中，Penumbra表达是低的或不可检出的（18)。尽管该后一 项的研究发现TER119+B细胞是骨髓中最高表达Tspan33的细胞，但本文所包括的我们自己 的数据表明活化B细胞中四旋蛋白33的表达是总骨髓中表达的40倍。后者的观测结果引导 我们得出结论，即活化的B细胞代表了在人体内具有最高的Tspan33/BAAM表达的细胞。运使 得Tspan33/BAAM成为一种作为治疗性抗体研发的祀标的独特的候选物W治疗淋己瘤或某 些人类自身免疫性疾病，其中B细胞设及它们的发病。
[0051] 人类四旋蛋白33(由TSPAN33编码）已经使用超过90种不同的组织和器官的基因表 达谱的综合数据库(基因表达的身体指数)被鉴定为一种存在于B细胞淋己瘤上的生物标志 物（19)。人类四旋蛋白33是与鼠类四旋蛋白33具有97%同源性的四跨膜蛋白超家族的成员 并且设及造血作用（18)。小鼠 BAAM基因与人类BAAM基因之间的高度保守性使得小鼠模型适 用于设及抗体祀向疗法的临床前研究。
[0052] 人类四旋蛋白33蛋白质序列提供于图1中。人类TSPAN33蛋白质相比于小鼠 TSPAN33蛋白质的比对示于图2中。人类TSPAN33核巧酸序列的登录号是NM_178562(W引用 的方式并入本文），而人类TSPAN33蛋白质序列的登录号是NP_848657(W引用的方式并入本 文)。
[0053] 已经使用基因表达的综合数据库（基因表达的身体指数:BIGE(19))在人体的105 种组织和细胞中对Tspan33的表达进行定位。BIGE数据库表明Tspan 33的表达具有高度特 异性并且最高水平的表达在活化的B细胞中（图3)。本申请的发明人因此决定将运种分子重 亲if命名为BAAM或B细胞活化相关分子(B cell心tivation Associated心Iecule)，运个名 称更好地反映了-它在人类中的表达接式。具W显著水平的^AAM表达的^一个部位是肾脏 (图3)。使用人类RNA的qRT-PCR确认了BAAM表达的运种模式（图4)，在肾脏中检测到高水平 的BAAM mRNA。包括一级淋己器官（骨髓和胸腺)和二级淋己器官(脾脏)在内的所有其他组 织W及休止的B细胞的BAAM表达呈阴性。
[0054] 在BAAM表达的淋己外部位当中，在肾脏中的表达引起了对在体内可能治疗性使用 抗BAAM抗体的擅化。为了评估针对BAAM的治疗性单克隆抗体在肾脏中脱祀部位祀向的可能 性，使用抗BAAM多克隆抗体进行免疫组织化学（图8)。运些结果掲示BAAM在肾脏的近曲小管 和远曲小管中表达，而淋己细胞、神经、肾脏集合管W及肾小球不表达BAAM。近曲小管和远 曲小管衬有上皮刷状缘细胞，运些细胞设及在尿液滤过期间分泌和吸收蛋白质、离子W及 有机溶质。BAAM在肾脏中的表达因此与B细胞活化无关并且可能设及运些细胞中的囊泡运 输或信号转导，运是因为四旋蛋白作为一个家族已经与运些功能相关联（16)。重要的是，只 有低分子量的蛋白质可W从血流的输入血管穿过肾小球囊腔并且进入曲小管中，其中尿液 将被集合W转移至膀脫中。因此，祀向BAAM的治疗性单克隆抗体应当不会触及到它们的祀 标并且影响肾脏功能，运是因为抗体不会进入运个囊腔中。此外，已经报道，肾脏上皮细胞 对于基于生物的细胞毒性剂是无感受性的并且还据报道，肾细胞癌对ADCC具有抗性(20)。 综上所述，运些数据表明T