针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明属分子影像学技术领域，涉及一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]癫痫是以慢性、自发性、反复性为其临床特点的最常见神经病症之一。据统计，我国现有癫痫患者约900万，每年新增病例45万，其中约1/3患者虽经正规抗癫痫药物治疗，但发作仍不能得以控制，明显增加了病情严重性、死亡率和社会家庭经济负担。目前，癫痫灶切除手术效果较为肯定，但临床实践显示，手术难以完全切除，且致残率高，严重影响病人的生活质量。分析其重要原因之一是，癫痫作为一种神经元异常放电引起的大脑功能紊乱的疾病，按病因学可分为存在脑部结构/代谢异常的症状性癫痫和目前常规检查无法发现异常病灶的特发性/隐源性癫痫。脑电图(electroencephalogram, EEG)仍是癫痫灶最为常用的检查方法，但EEG的空间分辨率很低，头皮EEG检测对于发掘脑深部或某些不敏感部位的致痫灶敏感性极低。因此，如何特异性显示未有或不易检查出形态异常的那部分特发性/隐源性癫痫灶，增加了手术的精确性和安全性，提高了痫灶切除率和癫痫控制率，减少了手术并发症，是当前临床工作需要急迫解决的课题，也是目前有关癫痫研究中的热点和难点。
[0003]现代医学中，分子影像学(Molecular Imaging, Ml)利用当今医学上广泛应用的医学影像技术对生物体内部的生理和病理过程在分子水平进行无损伤的实时成像，了解体内特异性基因或蛋白质表达的部位、水平、分布及持续时间，可在活体内精细显像，特异性高。所述的分子影像的基本原理是体内引入分子探针，通过探针与靶点物质(如受体、蛋白、核酸等)特异性结合，应用高精度的成像设备对分子进行成像，有望提高特发性/隐源性癫痫的检出率和准确率。
[0004]目前，神经影像学技术主要有CT (Computer Tomography)、磁共振成像(MagneticResonance Imaging, MRI)、超声成像、光学成像及正电子发射体层摄影(Posit1nEmiss1n Tomography, PET)等；其中，CT与超声成像因分辨率及敏感性低，均不适宜进行分子影像学研究；光学成像与PET能显示组织功能、代谢及分子信息，但是由于其在组织内的空间分辨率较低，从而限制了其单独应用。MRI由于有着精细的空间分辨率和较高的组织分辨率，可对深部组织的分子影像学特征进行精细准确的定位、定量分析，已成为最理想的分子影像学分析技术之一。然而，常规MRI对信号探测的敏感性仍然较低，目前所用的MRI造影剂缺乏特异性，不能的与靶点物质高亲和力结合，并且一般只能检测到组织中微摩尔级的顺磁性成分含量，需要通过信号扩增系统来提高其敏感性。当前，本领域中以超小型超顺磁性氧化铁粒子(Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide,USP10)为基础的纳米探针，因其半衰期较长、在组织中广泛分布，易于在细胞间通透移动，T2*效应致信号强度明显降低，方法简单，重复性好，适用于带有特定分子的细胞及组织显像，已成为分子影像学研究热点。
[0005]研究表明，P-糖蛋白是表达在血脑屏障毛细血管内皮细胞近管腔侧的多药转运体，能识别多种抗癫痫药物，并将其泵出血脑屏障，减少病灶区域内神经元周围细胞外液抗癫痫药物的有效浓度，降低药物的效价，从而无法抑制癫痫发作。因此P-糖蛋白表达增多是引起癫痫多药耐药的重要原因。以P-糖蛋白作为纳米磁共振对比剂靶点物质具有几个主要的优势:第一，纳米磁共振对比剂通过癫痫部位的增强透过和滞留效应可以提高病灶部位的分布，降低非靶向部位的分布，提高对比剂的显像效果，降低药物的毒副作用；第二、癫痫灶毛细血管内皮细胞管腔面特异性高表达，而正常细胞不表达或低表达P-糖蛋白，在纳米磁共振对比剂表面链接一个靶向功能分子，通过靶向功能分子与癫痫灶细胞表面的P-糖蛋白特异性结合，能够准确、直观显示癫痫灶真实的生物学边界；第三、P-糖蛋白存在于毛细血管内皮细胞管腔面，分子探针不需要通过血脑屏障即可通过特异性结合而显像；第四、P-糖蛋白分子成像还有助于临床评价抗癫痫治疗的疗效、评估疾病的预后。
[0006]线性短狀3-Methylbutyryl-Val-Val-Sta-Ala-Sta-Cys (简称 Pepstatin A,胃酶抑素A)分子量小，结构稳定、与P-糖蛋白亲和力高、不干扰细胞代谢等优点(SharomFJ.The P-glycoprotein multidrug transporter.Essays B1chem, 2011,7 ；50(1): 161-78.)，易通过共价键与USP1结合，有望介导该短肽修饰的纳米磁共振对比剂显示癫痫灶。目前国内外未见报道。
[0007]目前，现有诊断技术无法从分子机制层面解决癫痫灶的早期准确显示这一问题，同时现有对比剂不能通过量化反映P-糖蛋白的表达量从而有助于早期提示是否为耐药性癫痫、以达到帮助临床提高治疗的精确性和安全性，也不存在一种递药系统导向性地将相关治疗药物靶向运至病灶、从而实现显影、治疗一体化。
[0008]根据上述背景，本申请发明人针对现有技术缺陷，拟以该短肽为靶向功能分子，聚乙二醇-超小型超顺磁性氧化铁粒子(PEG-USP10)为载体，附以荧光标记物，构建一种全新的脑癫痫灶靶向纳米磁共振对比剂。
【发明内容】
[0009]针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂及其制备与应用；具体涉及一种短肽修饰的纳米靶向对比剂。本发明对比剂可通过脑癫痫灶血脑屏障毛细血管内皮细胞与P-糖蛋白特异性结合，直观显示癫痫灶真实的生物学边界，提高癫痫的检出率和准确率。
[0010]第一方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，所述纳米磁共振对比剂包括超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)、胃酶抑素A、免疫荧光标记物、聚乙二醇(PEG)。
[0011]优选地，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子的表面活性基团包括羧基、马亚酰亚胺基、疏基、胺基、生物素或未和素。
[0012]优选地，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)的直径在50nm以下；所述USP1安全性高，可生物降解，主要缩短组织T2时间，可与多种配体连接形成靶向对比剂，灵敏度、特异度高。
[0013]更优选地，所述超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)的粒径为10?20nm。
[0014]优选地，所述免疫荧光标记物包括异硫氰酸荧光素(FITC)。
[0015]优选地，所述聚乙二醇的分子量为1000?20000 ；
[0016]更优选地，所述聚乙二醇的分子量为2000?5000。
[0017]第二方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂的制备，所述制备的具体包括如下步骤:
[0018]步骤一、将超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL)及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-免疫荧光标记(DSPE-PEG-免疫荧光标记)按重量比为(I?3): (8?12):1混合，溶于二氯甲烷，冰水浴超声1min ;37°C旋蒸去除二氯甲烷；4°C下2500rpm离心后弃上清，水分散沉淀，获得水分散纳米粒；
[0019]步骤二、向水分散纳米粒加入巯基活化的胃酶抑素A，搅拌；2500rpm4°C离心，弃上清；用缓冲液分散沉淀，得靶向纳米磁共振对比剂。
[0020]优选地，步骤二中，所述缓冲液包括磷酸缓冲液；所述磷酸缓冲液的浓度为PH6?8的0.0lM的磷酸缓冲液。
[0021]优选地，步骤二中，所述水分散纳米粒中超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)与巯基活化的胃酶抑素A的重量比为10:1。
[0022]步骤二中，水分散纳米粒和巯基活化的胃酶抑素A通过共价结合反应得靶向纳米磁共振对比剂。
[0023]第三方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂在制备特异性显示高表达P-糖蛋白癫痫灶的临床诊断试剂中的应用；所述临床诊断试剂包括癫痫灶的早期MRI分子影像诊断试剂。
[0024]第四方面，本发明提供一种针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂递药系统，所述递药系统的靶向功能分子为线性短肽胃酶抑素A，荧光标记物为异硫氰酸荧光素(FITC)，纳米载体为表面聚乙二醇修饰的超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1);抗脑癫痫药物以包裹或共价连接的方式与纳米载体结合，线性短肽通过共价连接的方式与纳米载体表面的聚乙二醇相连。
[0025]优选地,所述递药系统的粒径为30?50nm。
[0026]优选地，所述抗脑癫痫药物为对脑癫痫有抑制、治疗效果的或与其他药物有协同抑制、治疗效果的药物组分。
[0027]本发明针对脑癫痫灶的靶向纳米磁共振对比剂，是以毛细血管内皮细胞管腔面P-糖蛋白为靶点，由聚乙二醇(PEG)，超小型超顺磁性氧化铁粒子(USP1)，荧光标记物异硫氰酸荧光素(FITC)及导向性短肽分子胃酶抑素A组成。该递药系统一方面可通过与P-糖蛋白特异性结合，靶向脑癫痫灶毛细血管内皮细胞，另一方面通过长循环纳米粒的增强渗透和滞留作用向癫痫组织内蓄积，蓄积在组织内的纳米粒可以被MRI及荧光显微镜所识别，实现脑癫痫灶的双模态显影。
[0028]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0029](I)从分子机制层面解决现有技术无法早期准确显示癫痫灶，能直观显示特发性/隐源性癫痫；
[0030](2)对比剂与P-糖蛋白特异性结合，通过量化间接反映P-糖蛋白的表达量，有助于早期提示是否为耐药性癫痫，帮助临床提高治疗的精确性和安全性，评价疗效、评估预后；[0031 ] (3)对比剂结合对脑癫痫有抑制、治疗效果的或与其他药物有协同抑制、治疗效果的药物组分，冀望通过靶向递药为及时干预提供帮助，实现显影与治疗一体化。
【附图说明】
[0032]通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更