一种口蹄疫o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种既可免疫预防，又能区分自然感染 和疫苗免疫的口蹄疫〇、A型双价灭活标记疫苗。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生 偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播速度快，发病率高，曾多次在 世界范围内发生流行性暴发，给发病地区的政治、经济造成巨大损失。鉴于此，世界动物卫 生组织（OIE)将其列为必报疫病，我国规定为一类动物传染病。FMD的病原是口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)，属于小RNA病毒科（Picornaviridae) 口蹄疫病毒 属(Aphthovirus)。病毒具有七个血清型(A，0，C，Asial，SAT1，SAT2和SAT3)，型间不交叉保 护。FMDV的多型性给FMD的预防和控制带来了巨大的困难。
[0003] 口蹄疫在我国长期流行，对我国的政治、经济发展带来了严重的危害。据报道，我 国每年仅口蹄疫引起的损失，占所有疾病损失的38%，直接经济损失150~200亿元，间接损 失高达400亿元左右。近几年来，我国的口蹄疫疫情发生更加频繁，呈现多血清型（特别0型 和A型）和多谱系病毒共存的局面。疫苗免疫和精确区分疫苗免疫动物与自然感染动物是 FMD防控的两个关键环节。但在口蹄疫灭活疫苗的制备过程中，一些游离的，以及与病毒粒 子大小相近的非结构蛋白复合物难以清除，他们或多或少的在疫苗中残留，多次免疫动物 后也能在动物体内产生相应的抗体。因此以检测病毒非结构蛋白抗体为金标准的鉴别诊断 技术也难以精准区别疫苗免疫和自然感染动物，这给疫病防控和活畜贸易造成了极大障 碍。
[0004] 针对上述不足，利用反向遗传操作技术发展携带有特定分子标记的鉴别诊断疫苗 成为一个新的技术途径。国际上防制口蹄疫的成功经验也显示双价或多价灭活疫苗对易感 动物进行预防接种是多血清型口蹄疫综合防制的最有效措施之一。但是到目前为止，尚未 研制出同时预防〇、A两型口蹄疫的标记疫苗。因此，一种既可同时预防0、A型口蹄疫流行毒 株的攻击，又能够用配套的鉴别诊断方法精确区分免疫动物和自然感染动物的0、A型双价 口蹄疫灭活标记疫苗的研制对于我国的口蹄疫的有效预防、控制具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种既可同时预防0、A型口蹄疫流行毒株的攻击，又能够用 配套的鉴别诊断方法精确区分免疫动物和自然感染动物的双价灭活标记疫苗。
[0006] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种口蹄疫0、A型双价灭活标记疫苗，该标记疫苗种毒为0型口蹄疫重组病毒rV-0/3Ad和A型口蹄疫重组病毒A/rV-2，其中，所述0型口蹄疫重组病毒rV-0/3Ad的基因组序列 为SEQ ID N0:2,该0型口蹄疫重组病毒rV-0/3Ad含3A 91-114位氨基酸的缺失，并且含有緬 甸98VP1氨基酸的编码序列;所述A型口蹄疫重组病毒A/rV-2的基因组序列为SEQ ID N0:4， 该重组病毒含3A104-115位氨基酸的缺失。
[0008] 本发明还公开了一种口蹄疫0、A型双价灭活标记疫苗的制备方法，包括下述步骤：
[0009] (1 )0型口蹄疫标记疫苗毒株的构建：1 )0型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒 的构建；2)置换VPl基因和缺失3A蛋白91-114氨基酸编码区的0型口蹄疫病毒基因组全长 cDNA重组质粒的构建;3)拯救缺失3A蛋白91-114氨基酸编码区的重组病毒rV-0/3Ad，作为0 型口蹄疫标记疫苗毒株；
[0010] (2)A型口蹄疫标记疫苗毒株的构建：1)A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒 的构建;2)缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的 构建;3)拯救缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的重组病毒A/rV-2,作为A型口蹄疫标记疫 苗毒株；
[0011] (3) 口蹄疫0、A型双价灭活标记疫苗的制备：1 )0型口蹄疫标记疫苗毒株rV-0/3Ad 和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的增殖培养;2)0型口蹄疫标记疫苗毒株rV-0/3Ad和A型 口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的病毒含量测定及特异性检验;3)0型口蹄疫标记疫苗毒株rV-0/3Ad和A型口蹄疫标记疫苗毒株A/rV-2的灭活及其灭活抗原的检验;4)采用一步乳化法配 制口蹄疫0、A型双价灭活标记疫苗.
[0012] 在上述基础上，还包括如下步骤:5) 口蹄疫0、A型双价灭活标记疫苗安全性及效力 检验;6)利用0、A型双价标记疫苗进行多次免疫与鉴别诊断。
[0013] 优选地，所述口蹄疫0、A型双价灭活标记疫苗的配制步骤具体为:采用一步乳化 法，即先配制佐剂，取疫苗佐剂加入到乳化器中，边搅拌边缓慢加入已灭活的抗原，该抗原 包含已灭活的0型口蹄疫抗原rV-0/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2，待抗原和佐剂搅匀后，一 次性通过均质机乳化成油乳剂疫苗，即为〇、A双价口蹄疫灭活标记疫苗。
[0014] 优选地，疫苗佐剂和已灭活抗原按照体积比为1:1，其中，该已灭活抗原由等重量 已灭活的〇型口蹄疫抗原rV-0/3Ad和A型口蹄疫抗原A/rV-2混合而成。
[0015] 研究结果表明，本发明提供的0、A型双价灭活标记疫苗既可以预防0、A型口蹄疫流 行毒株的攻击，又能够准确区分免疫动物和自然感染动物，在口蹄疫免疫预防与疫情控制、 进出口动物及其肉制品检验检疫等领域具有重要的市场价值和指导意义。
【附图说明】
[0016] 图1.为FMDV 0ZK/93-08株全基因组PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果（1.DL5000DNA marker; 2 · ZlPCR片段;3 · Z2PCR片段;4 · Zl和Z2PCR融合片段;5 · Z3PCR片段;6 · Z4PCR片段）。
[0017] 图2为FMDV 0ZK/93-08株基因组全长cDNA克隆的构建策略示意图。
[0018] 图3显示了重组质粒pOMQ-Zl 234D转染BHK细胞60h后引起的CPE (A:正常BHK细胞， B:出现CPE的BHK细胞）。
[0019] 图4为拯救病毒rV-0/3Ad与0ZK/933A蛋白氨基酸的比对。
[0020] 图5为拯救病毒rV-0/3Ad与0ZK/93VP1蛋白氨基酸的比对。
[0021 ]图6为间接免疫荧光检测拯救病毒在BHK上的复制。
[0022] 图7显示了FMDV A/GDMM/CHA/2013株全基因组PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果 (1 · DLl2000DNA marker; 2 ·AlPCR片段；3 ·A2PCR片段;4 ·Al和A2PCR融合片段；5 ·A3PCR片段； 6.八4?0?片段）。
[0023] 图8显示了FMDV A/GDMM/CHA/2013株全长cDNA分子克隆的构建策略。
[0024] 图9显示了重组质粒pQAGD/3A104-115转染BSR/T7细胞60h后引起的CPE(A:出现 CPE的BSR/T7细胞，B:正常BSR/T7细胞）。
[0025] 图10为标记病毒A/rV-2和A/⑶MM/CHA/2013病毒3A蛋白氨基酸的比对图。图11为 重组病毒的间接免疫荧光检测结果。
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 一、0型FMDV标记疫苗毒株的构建
[0029] 1、FMDV 0ZK/93-08株基因组全长cDNA克隆的构建
[0030] 根据FMDV 0ZK/93-08全基因组序列设计下列寡核苷酸引物，由上海桑尼有限公司 合成。（FMDV 0ZK/93-08毒株在农业部兽医局指定口蹄疫参考实验室保藏，公众可通过农业 部兽医局批示的委托函获得）。
[0031] 表1构建FMDV 0ZK/93-08株全长cDNA克隆的引物
[0033] 提取FMDV 0ZK/93-08株(购买自国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄 疫参考实验室）的总RNA，用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物分别反转录合成第一链cDNA，反转录反应 体系见表2。
[0034]表2反转录反应体系
[0036] 反应条件:离心混匀后，42°C水浴lh，置_20°C冰箱中备用。
[0037] 以合成的第一链cDNA为模板，用4对引物Ζ1/Ζ1-2、Ζ2/Ζ2-2、Ζ3/Ζ3-2和Z4/Z4-2,分 别扩增获得0ZK/93-08病毒全基因组4个相互重叠的cDNA片段，分别命名为Z1、Z2、Z3和Z4 (见图I)，扩增体系见表3。
[0038] 表3 PCR扩增体系
[0041 ]扩增程序为：94°C预变性Imin后，98°C20min，68°Clmin/lkb，30个循环后，72°C 8min〇
[0042]纯化回收Zl和Z2片段，并以回收的这两个片段为模板，用引物Z1/Z2-2进行融合 PCR，得Z12片段(见图1)212片段与pMD20-T载体(大连宝生物生物有限公司）连接，得到重 组质粒PMD-Z12DPMD-Z12和pBluescript II SKhdv质粒载体（（pBluescriptSKhdv载体在文 献"《华北农学报》2010年第25卷第3期，曹伟军，李平花，白兴文等，口蹄疫病毒0/HN/93疫苗 株的拯救及病毒活性鉴定"中