用于预防转移形成和/或复发的多糖的制作方法
【专利说明】用于预防转移形成和/或复发的多糖
[0001 ] 描述
[0002] 本发明涉及包含通过α-糖苷键连接的任选取代的单糖单元，用于通过向罹患癌症 的受试者的体腔施用来预防转移形成和/或复发的多糖。本发明还涉及一种用于预防罹患 癌症的受试者中的转移形成的方法，其包括向所述受试者的体腔施用所述组合物，以及由 此预防所述受试者中的转移形成。本发明也涉及组合物以及包括如本文所述的多糖和使其 溶解的药学上可接受的物质(means)的试剂盒和包括如本文所述的多糖和用于施用其的部 件的装置。
[0003] 源于淀粉的多糖已例如作为血浆置换中的容量扩张剂而用于医学中以及也用于 临床血液透析中（Sommermeyer等，1987，Krankenha uspharmazie，8(8) :271_278;Weidler 等，1991，Arzneimittelforschung/Drug Research，41:494_498)。常常，特定形式的轻烷基 化淀粉(HAS)，特定来说羟乙基化淀粉(HES)用于这些目的。
[0004] 多年来，已描述多糖的其它潜在医学用途。
[0005] β-葡聚糖已被作为全面免疫刺激剂，以口服和静脉内用药形式加以研究，特定来 说在癌症治疗中（A.Weitberg，J Exp Clin Cancer Res(2008)27:40;TO2007/084661)以及 在小鼠肉瘤模型中(US 4,207,312)加以研究。发现β-葡聚糖例如对癌细胞不具有直接细胞 毒性作用，而是具有免疫刺激作用（Chan等，J Hematol 0ncol(2009)，2:25;W02004/ 030613)。
[0006] DE 40 23 788 Al描述了羟烷基淀粉用于内耳的高压氧疗法的用途。唯一实施例 描述了向接受高压治疗的患者施用包含银杏(Ginkgo biloba)的提取物的HES溶液。然而， 未指不这种治疗有治疗效果。
[0007] 也存在对包含聚葡萄糖作为药物活性化合物载体的溶液的用途的若干公开:US 6,207,654教导HES用以防止血清蛋白质从毛细血管内皮连接部泄漏的用途，并且提出使用 包含HES和白介素-2(interleukin-2)的溶液来治疗病毒性和细菌性感染，目的在于预防恶 性肿瘤。Mohamed等描述（EJS0(2003)29:261)并综述（Surg Oncol Clin N Am(2003)12: 8 13)等张高分子量溶液作为载体用于腹膜内化学疗法的优势。此外，艾考糊精 (icodextrin)已被描述为在小鼠模型中用于腹膜内腺病毒肿瘤治疗中的载体溶液的组分， 显示艾考糊精溶液相较于PBS使总体存活期有所改进(Rocconi等,Gynecologic Oncology (2006)103:985)。
[0008] 此外，聚葡萄糖已被推荐用于降低手术后粘附形成，参见例如Van den Tol等 (Surgery(2005)137(3):348)、US 5,807,833和I.Bekes(Dissertation an der Medizinischen FafcultEt d e r RffTH Aachen(2008) : ^ Adhasions- und Nidationsprophylaxe nach i .p. Implantation von SC0V. ip-Zellen i n SCID-Mause mittels Icodextrin, HyaluiOnsiiureund physiologischerNaCl-Ldsung1")。后述文件 也考查了艾考糊精溶液用于预防肿瘤细胞在引入腹腔中的病灶中筑巢(nidation)的用途。 相较于对照组(NaCl溶液)未见显著作用。
[0009] 癌症仍然是一个主要死亡原因，尤其在发达国家。因此，对改进癌症治疗和预防的 研究仍然是许多研究项目的焦点。多年来，已设计用于治疗原发性癌症的方法，其在大多数 情况下至少在最初是有效的。然而，视癌症的种类而定，存在癌瘤再生长(复发)和/或癌细 胞向身体其它部位扩散(转移）的风险。因此，五年存活率从例如对于原位乳腺癌的100%变 化至对于卵巢癌的25%以及对于胰腺癌低至大约6%的值。因此，近年来，研究的主要焦点 已从治疗原发性癌症向预防和治疗转移和复发转变。对于体腔(尤其是腹腔）的癌症，这个 焦点尤其具有充分理由；在腹腔中生长的癌瘤仅在它们已达到某一尺寸之后引起症状，以 致肿瘤细胞从肿瘤脱离，从而导致转移的风险在那些肿瘤中会大大增加。这个影响造成被 诊断有所述癌症的患者的预后常常深不可测。
[0010] 因此，本领域中需要提供用以预防肿瘤转移和复发的手段和方法。技术问题通过 在权利要求和下文中表征的实施方案来解决。
[0011] 因此，本发明涉及包含通过α-糖苷键连接的任选取代的单糖单元，用于通过向罹 患癌症的受试者的体腔施用来预防转移形成和/或复发的多糖。
[0012] 如本文所用，术语"具有"、"包含"或"包括"或其任何语法变化形式以非排它性方 式使用。因此，这些术语可指以下两种情况:其中，除由这些术语引入的特征之外，在给定情 形下描述的实体中不存在其它特征，以及其中存在一种或多种其它特征的情况。举例来说， 表述"Α具有Β"、"Α包含Β"和"Α包括Β"是指以下两种情况:其中，除B之外，在A中不存在其它 要素（即其中A仅仅以及排它地由B组成的情况），以及其中，除B之外，在实体A中也存在一种 或多种其它要素，诸如要素 C、要素 C和D、或甚至其它要素的情况。
[0013]此外，如本文所用，术语"优选地"、"更优选地"、"最优选地"、"特定来说"、"更特定 来说"、"具体来说"、"更具体来说"或类似术语连同任选特征一起使用，而不限制替代性可 能性。因此，由这些术语引入的特征是任选特征，并且不意图以任何方式限制本发明的范 围。如本领域普通技术人员将认识到，本发明可通过使用替代性特征来进行。类似地，由"在 本发明的一实施方案中"或类似表述引入的特征意图是任选特征，而不关于本发明的替代 性实施方案进行任何限制，不关于本发明的范围进行任何限制以及不关于组合以所述方式 引入的特征与本发明的其它任选或非任选特征的可能性进行任何限制。
[0014] 此外，如本文所用，与参数的值关联的术语"约"涉及所述值包括是所述值的± 10%、优选±5%、更优选±2%、最优选± 1 %的范围。类似地，关于术语"基本上由…组成 (essentially consisting of/consisting essentially of)"，当 A至少在90 %、优选 95%、更优选98%以及最优选99%的程度上由B组成时，A基本上由B组成(A essentially consists of B/A consists essentially of B)〇
[0015] 如本文所用的术语"多糖"涉及包含通过a-糖苷键(a糖苷键)连接的任选取代的单 糖单元的多糖。术语a-糖苷键为本领域普通技术人员所知，并且涉及糖的半缩醛基团与第 二分子(优选是糖）的羟基之间的共价键。因此，"a_糖苷键"是例如在D-吡喃葡萄糖的情况 下，以轴向定向固定a位中的异头碳原子的糖苷键。此外，术语"糖苷键连接"涉及通过糖苷 键加以连接。本领域普通技术人员应了解在糖苷键的形成期间，水分子被释放，并且因此例 如以糖苷键啮合的葡萄糖单元优选被称为脱水葡萄糖。
[0016] 通常，含有a-糖苷键的多糖比含有β-糖苷键的那些更易于由人体消化。
[0017] 用于分析多糖的方法，并且特定来说用以确定a-糖苷键的存在的方法在本领域中 是熟知的。优选地，根据标准方案，通过IR和匪R分析，诸如ID和/或2D匪R光谱法，特定来 说1!1-匪1?、13(：-匪1?、批0(：、1'(^3￥、〇)3￥、从^3￥等来进行测定和/或测量。
[0018]优选地，多糖是由或可由活生物体产生的多糖，或更优选是其衍生物。最优选地， 多糖是由来自植物界的生物体产生的多糖。特定来说，多糖可由维管植物(导管植物)产生； 通过使用源于细菌的酶产生;或可为所述多糖的衍生物。
[0019] 优选地，在本发明的多糖中，超过90 %的单糖单元通过α-糖苷键连接。更优选地， 本发明的多糖中超过95%的单糖单元通过α-糖苷键连接。最优选地，本发明的多糖中超过 98%的单糖单元通过α-糖苷键连接。
[0020] 术语"单糖"为本领域普通技术人员所知。优选地，单糖是己糖，更优选是葡萄糖。 最优选地，单糖是D-葡萄糖。优选地，本发明的多糖可包含超过一个单糖种类。如下文所述， 包含在本发明的多糖中的单糖单元被取代或未被取代。
[0021] 本领域普通技术人员应了解两个葡萄糖分子之间的糖苷键也可被称为"葡糖苷 键"。此外，由作为单糖单元的脱水葡萄糖单元组成或基本上由其组成的多糖(特定来说生 物聚合物)被称为"葡聚糖"。因此，例如由通过α-l，6-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成或 基本上由其组成的多糖被称为α-(1，6)_葡聚糖;在加以必要的变更下，由形成α-l，4_糖苷 键连接的分子的主链以及通过α-1，6_糖苷键形成的分支点的脱水葡萄糖单元组成或基本 上由其组成的多糖将被称为α-(1，4/1，6)_葡聚糖。本领域普通技术人员也应了解多糖中的 脱水葡萄糖单元常为简单起见而被称为"葡萄糖单元"或"葡萄糖分子"。
[0022] 在本发明的多糖的一优选实施方案中，包含在多糖中的至少70 %的单糖单元是脱 水葡萄糖和/或取代的脱水葡萄糖单元。更优选地，包含在多糖中的至少80 %的单糖单元是 脱水葡萄糖和/或取代的脱水葡萄糖单元。甚至更优选地，包含在多糖中的至少90%的单糖 单元是脱水葡萄糖和/或取代的脱水葡萄糖单元。更优选地，包含在多糖中的至少95%、更 优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%以及更优选至少99%的单糖单元是脱水 葡萄糖和/或取代的脱水葡萄糖单元。因此，在一优选实施方案中，本发明的多糖是葡聚糖 或取代的葡聚糖。
[0023] 优选地，任选取代的单糖单元(例如任选取代的脱水葡萄糖单元)通过α-l，4_糖苷 键和/或通过α-l，6-糖苷键和/或通过α-l，3-糖苷键和/或通过α-l，2-糖苷键连接。因此，优 选地，本发明的多糖是包含α-l，4-糖苷键和/或α-l，6-糖苷键和/或α-l，3-糖苷键和/或α-1，2糖苷键的多糖。
[0024]更优选地，多糖具有由α-l，4-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和/或α-l，6-糖苷键 连接的脱水葡萄糖单元和/或α-l，3-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和/或α-l，2-糖苷键连 接的脱水葡萄糖单元组成的主链，优选是由α-l，4_糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和/或α-1，6-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和/或α-l，3-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成的主 链。
[0025]根据一个优选实施方案，多糖具有由α-l，4-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成的 主链。根据另一优选实施方案，多糖具有由α-l，3_糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成的主 链。根据另一优选实施方案，多糖具有由α-l，6_糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成的主链。 根据另一优选实施方案，多糖具有由α-l，6_糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和α-l，4_糖苷键 连接的脱水葡萄糖单元组成的主链。根据另一优选实施方案，多糖具有由α-l，6_糖苷键连 接的脱水葡萄糖单元和α-l，3-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成的主链。根据另一优选实 施方案，多糖具有由α-l，6_糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和α-l，3_糖苷键连接的脱水葡萄 糖单元和α-1，4-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元组成的主链。
[0026] 在这个情形下的术语"主链"是指由共同产生分子的连续链的一系列共价键合的 构筑嵌段，特定来说α-l，4-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和/或α-l，6-糖苷键连接的脱水 葡萄糖单元和/或α-1，3-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元和/或α-l，2-糖苷键连接的脱水葡 萄糖单元形成的多糖的主链。优选地，单糖单元的提供最佳结构连续性(即在键联的种类方 面的变化最小）的共价连接链被视为主链。应了解存在于这个链中的构筑嵌段可未被取代 或被取代，其中各构筑嵌段中的取代样式可相同或可彼此不同。此外，给定单糖构筑嵌段可 为分支点。因此，主链可被至少一个多糖链取代，从而产生支链多糖。
[0027] 举例来说(但不带限制性），明确涉及以下葡聚糖:具有α-1，4连接的主链以及α-1， 6_连接的分支点，以及优选包含每10个α-l，4键联平均约1个α-l，6键联的α-(1，4/1，6)_葡 聚糖;或具有例如α-l，4连接的主链以及α-l，6_连接的分支点，以及优选包含每10个α-l，4 键联平均小于约1个α-l，6键联的α-(1，4/1，6)_葡聚糖，或具有α-l，4-连接的主链以及α-l， 6连接的分支点，以及优选包含每30个α-l，4键联平均约1个α-l，6键联的α-(1，4/1，6)_葡聚 糖。
[0028] 本领域普通技术人员应了解，特定来说当术语"多糖"涉及生物多糖，即由或可由 活生物体产生（即由或可由活生物体获得）的多糖时，多糖本身可包含少量杂质，例如像主 链中或侧链中的杂质。因此，术语"多糖具有由…组成的主链"也指多糖包含所述少量杂质。 优选地，多糖的所述少量杂质占多糖的总质量的小于10%，更优选占多糖的总质量的小于 5%，更优选小于4%，更优选小于3%，更优选小于2%，更优选小于1 %，更优选小于0.5%， 以及最优选占多糖的总质量的小于〇. 1 %。
[0029] 优选地，多糖不包含呈β-l，3-糖苷键连接的脱水葡萄糖单元形式的杂质，更优选 地，多糖不包含呈糖苷键连接的脱水葡萄糖单元形式的杂质，最优选地，多糖不包含呈β_ 糖苷键连接的单糖单元形式的杂质。
[0030] 根据一优选实施方案，多糖包含α-l，4-糖苷键连接的任选取代的脱水葡萄糖单 J L 〇
[0031] 根据另一优选实施方案，多糖包含α-l，6-糖苷键连接的任选取代的脱水葡萄糖单 J L 〇
[0032] 根据另一优选实施方案，多糖包含α-l，4-糖苷键连接的和α-l，6-糖苷键连接的任 选取代的脱水葡萄糖单元。
[0033] 根据一个优选实施方案，多糖中至少90 %的糖苷键联是α-l，4-糖苷键联和/或α-1，6-糖苷键联。更优选地，多糖中至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少 98%、更优选至少99%的糖苷键联是α-l，4-糖苷键联和/或α-l，6-糖苷键联。
[0034] 优选地，本发明的多糖因此是任选取代的α-(1，6)_葡聚糖、任选取代的α-(1，4)_ 葡聚糖(例如麦芽糖糊精）、任选取代的α-(1，6/1，4)_葡聚糖(例如普鲁兰多糖(pullulan)) 或具有α-l，4连接的主链以及α-l，6连接的分支点的任选取代的α-(1，4/1，6)_葡聚糖。
[0035] 本发明的多糖可为碱性或酸性多糖或两性离子或中性多糖。优选地，多糖是中性 的，即优选是不带电荷的多糖。
[0036] 优选地，本发明的多糖具有至少IkDa、更优选至少5kDa、更优选至少IOkDa、更优选 至少13kDa的数量平均分子量，在本文中被称为"平均分子量"。优选地，多糖具有至多 1200kDa、更优选至多lOOOkDa、最优选至多800kDa的平均分子量。优选地，多糖具有在5至 1200kDa、更优选10至lOOOkDa、以及更优选13至800kDa的范围内的平均分子量。最优选分子 量也显示在下文和实施例中。测定多糖的分子量的方法在本领域中是已知的。通常根据以 下方法测定本发明的多糖的Mw和Mn:如在本发明的情形下所用的术语"平均分子量"涉及如 根据MALLS-GPC(多角度激光散射-凝胶渗透色谱法)测定的重量。对于测定，串联连接的2个 Tosoh BioS印GMPWXL柱（13μπι粒径，直径7.8mm，长度30cm，物品号08025)用作固定相。如下 制备流动相。在容量瓶中，将3.74g乙酸钠*3H 20、0.344g NaN3溶解于800ml Mi 11