用于治疗口炎性腹泻的组合物和方法
【专利说明】用于治疗口炎性腹泻的组合物和方法
[0001 ]相关申请
[0002] 本申请要求2013年8月14日提交的美国临时专利申请序列号61/865,787的优先 权，该申请的全部内容通过引用并入本申请中。
[0003] 联邦资助声明
[0004] 本发明是在国防高级研究计划局给予的HR0011-08-1-0085的政府支持下完成的， 政府享有本发明的某些权益。
【背景技术】
[0005] 口炎性腹泻(celiac sprue)是一种极常见的疾病，该病是在小麦、大麦、黑麦产品 中发现的被称为"麸质"的食用蛋白质在遗传学上易感染个体的小肠中引起的免疫反应。由 此导致的炎症会造成小肠绒毛的退化，阻碍营养物的吸收。其症状会在儿童早期或人生的 后期出现，严重程度分布广泛，从腹泻、疲劳、体重减轻到腹胀、贫血及神经症状。目前对这 种伴随终生的疾病尚没有有效的治疗方法，只能从饮食中完全排除麸质。尽管仍有很大一 部分口炎性腹泻未被检测出来，但该病在美国和欧洲的患病率据估计占人口的〇. 5-1.0 %。 由于要在人类消化道的恶劣及强酸环境下特异性地、有效地降解麸质源性肽有着严苛的物 理和化学要求，很难找到合适的自然产生的酶以口服疗法治疗口炎性腹泻。
【发明内容】
[0006] 在一个方面，本发明提供了用于治疗口炎性腹泻的方法，包括给患有口炎性腹泻 的患者施用有效量的用于治疗口炎性腹泻的一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包括选 自由 SEQ ID 5:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其经加工的版本（口『〇。6886(1 version)组成的组中的多肽的氨基酸序列，或由选自由SEQIDN0S:75、74、76-89、95、97-98、102-111或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成。在一个实施例中，所 述一种或多种多肽包括包含了选自由SEQ ID勵8:75、74、77、78、82、88、98、105、111或其经 加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列的一种或多种多肽，或者由选自由SEQ ID N0s:75、74、77、78、82、88、98、105、lll或其经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列 组成的一种或多种多肽。在进一步的实施例中，所述一种或多种多肽包括含有SEQ ID NO: 89的氨基酸序列的多肽。
[0007] 在另一方面，本发明提供了分离的多肽，其选自由以下多肽或其经加工的版本组 成的组：
[0008] (a)SEQ ID N0:95,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基116是V或D; (i i)AA残基255是S、Κ或G; (ii i)AA残 基284是D; (iv)AA残基285是T; (V)AA残基286是A、T或N; (vi)AA残基312是S; (vii)AA残基 347 是 N; (viii)AA 残基 350 是 T或A;(ix)AA 残基 351 是N 或 G; (X)AA 残基 354是DjP(Xi)AASS 361是S或H;
[0009] (b)SEQ ID N0:75,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基106是D; (ii)AA残基246是S、K或G; (iii)AA残基 275是D; (iv)AA残基276是S; (V)AA残基277是A、T或N; (vi)AA残基303是S; (vii)AA残基338 是 S; (viii)AA残基 341 是T或 A; (ix)AA残基 342 是 N或 G; (X)AA残基 345 是Q 或DjP(Xi)AASS 352是S或H;
[0010] (c)SEQ ID NO:76,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基120是D; (ii)AA残基259是S、K或G; (iii)AA残基 288是D; (iv)AA残基289是T; (V)AA残基290是A、T或N; (vi)AA残基316是S; (vii)AA残基351 是S或N; (viii)AA残基354是A;(ix)AA残基355是N或G; (X)AA残基358是D;和(xi)AA残基365 是S或H;
[0011] (d)SEQ ID N0：78；
[0012] (e)SEQ ID N0:79,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基107是V或D; (ii)AA残基245是S、K或G; (iii)AA残 基274是D; (iv)AA残基275是T; (V)AA残基276是A、T或N; (Vi)AA残基302是S; (Vii)AA残基 337 是 S或N; (viii)AA 残基 340 是T或 A;(ix)AA 残基 341 是N 或G; (X)AA 残基 344是Q或DjP(Xi) AA残基351是SSH;
[0013] (f)SEQ ID N0:80,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i )AA残基76是V或D; (ii )AA残基206是S、K或G; (iii)AA残基 235是D; (iv)AA残基236是S; (V)AA残基237是A、T或N; (vi)AA残基262是S; (vii)AA残基297 是 S或N; (viii)AA残基 300 是 T或 A; (ix)AA残基 301 是N或G; (X)AA残基 302 是 Q或DjP(Xi)AA 残基309是SSH;
[0014] (g)SEQ ID N0:81，其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基105是D; (ii)AA残基244是S或K; (iii)AA残基272 是D; (iv)AA残基273是S; (V)AA残基274是A、T或N; (vi)AA残基299是S; (vii)AA残基334是N; (viii)AA残基337是T或A;(ix)AA残基338是N或G; (X)AA残基341 是Q或D;和(xi)AA残基348 是S或H;
[0015] (h)SEQ ID N0:82,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基106是V或D; (ii)AA残基244是S、K或G; (iii)AA残 基273是D; (iv)AA残基274是T; (V)AA残基275是A、T或N; (Vi)AA残基301 是S; (Vii)AA残基 336 是 N; (viii)AA 残基 339 是 T或A; (ix)AA 残基 340 是N 或 G; (X)AA 残基 343 是DjP(Viii)AAS 基350是S或H;
[0016] (i)SEQ ID N0:83,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基107是V或D; (ii)AA残基245是S、K或G; (iii)AA残 基274是D; (iv)AA残基275是T; (V)AA残基276是A、T或N; (Vi)AA残基302是S; (Vii)AA残基 337 是N; (viii)AA 残基 340 是 T或 A; (ix)AA 残基 341 是N 或G; (X)AA 残基 344 是 Q 或DjP(Xi)AA 残基351是SSH;
[0017] (j)SEQ ID N0:84,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基104是V或D; (ii)AA残基241是S、K或G; (iii)AA残 基270是D; (iv)AA残基271是S; (V)AA残基272是D、A、T或N; (vi)AA残基398是S; (vii)AA残基 33是S; (viii)AA残基336是A; (ix)AA残基337是N或G; (X)AA残基340是D;和(xi)AA残基347 是S或Η;
[0018] (k)SEQ ID Ν0:85,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基104是D; (ii)AA残基245是S、K或G; (iii)AA残基 274是D; (iv)AA残基275是S; (V)AA残基276是A、T或N; (vi)AA残基302是S; (vii)AA残基337 是 S或N; (viii)AA残基 340 是 T或 A; (ix)AA残基 341 是N或G; (X)AA残基 344 是 Q或DjP(Xi)AA 残基351是SSH;
[0019] (I)SEQ ID N0:86,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基118是V或D; (ii )AA残基250是K或G; (ii i )AA残基 279是D; (iv)AA残基280是S; (V)AA残基281 是A、T或N; (vi)AA残基307是S; (vii)AA残基342 是 S 或N; (viii)AA残基 345 是 A;(ix)AA 残基 346 是N 或G; (X)AA 残基 349 是 Q或 DjP(Xi)AASS 356是S或H;
[0020] (m)SEQ ID N0:87,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个、十个或所有十一个为真：（i)AA残基121是V或D; (i i)AA残基253是S、Κ或G; (ii i)AA残 基282是D; (iv)AA残基283是S; (V)AA残基284是A、T或N; (vi)AA残基310是S; (vii)AA残基 345 是 S; (viii)AA 残基 348 是 T或 A; (ix)AA 残基 349 是N 或G; (X)AA 残基 352 是 Q 或DjP(Xi)AA 残基357是SSH;
[0021 ] (n)SEQ ID N0:88,其中下述中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、 九个或所有十个为真：（i)AA残基111是S、K或G; (ii)AA残基139是D; (iii)AA残基140是T或 S; (iv)AA残基 141是D、A、T或N; (V)AA残基 164是S; (vi)AA残基 199是S或N; (vii)AA残基202 是T或A; (viii)AA残基203是N或G;(ix)AA残基204是Q或D;和(X)AA残基211是S或H;和
[0022] (o)SEQ ID NO:89。
[0023] 在其他方面，本方面提供了编码本发明的多肽的核酸，核酸表达载体包括本发明 的分离的核酸，重组宿主细胞包括本发明的核酸表达载体。
[0024] 在又一方面，本发明提供了组合物，包括：
[0025] (a)-种或多种多肽，包括选自由SEQ ID N0s:74-89、95、97-99和102-111或它们 经加工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列;和
[0026] (b)-种或多种其他多肽，包括选自由下述氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列：
[0027] (A)与SEQ ID N0:35的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列，其中：
[0028] (i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQ ID N0:34)肽;和
[0029] (ii)残基 278是 Ser，残基 78 是 Glu，残基 82 是 Asp;
[0030] (B)与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列，其中：
[0031 ] (i)所述多肽在pH为4时降解PQPQLP(SEQ ID N0:34)肽;和
[0032] (i i)残基467 是 Ser，残基 267 是 Glu，残基 271 是 Asp。
[0033] 在又一方面，本发明提供了药物组合物，包括本发明的分离的多肽、核酸、表达载 体、宿主细胞或组合物，与药学上可接受的载体。
【附图说明】
[0034]图1是示出了各种多肽切断结合了荧光基团和淬灭基团的麦醇溶蛋白的荧光类似 物的活性的图表。X-轴:特异性同源物数目。KWT=Kumamo I i S in-As。Y-轴:任意的酶单位。
[0035]图2是示出了在不同的pH水平下多肽切断麦醇溶蛋白的荧光类似物的活性的图 表。SC PEP:源自荚膜鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas capsulata)的脯氨酰内肽酶。WT: Kumamo I i s in-As Jax: KumaMax?。蓝条代表在所示pH水平下最佳的蛋白酶活性。
[0036]图3是示出了不同的多肽切断作为麸质降解产物的两种肽的活性的图表。X-轴是 以分钟计的时间，Y -轴是残余肽片段。Max = KumaMax?;K3 = Kumamolisin-As活性位点突变 株；H4M=同源物4(SEQ ID N0:75)KumaMax?-突变株；33 = 33mer肽（SEQ ID N0:72);26 = 26mer肽（SEQ ID N0:73)。
[0037]图4是示出了不同的其他多肽切断麸质的33mer肽降解产物（SEQ ID N0:72)的活 性的图表。
[0038] 详细说明
[0039]所有引用的参考文献的全部内容通过引用并入本申请中。在本申请中，除非另有 说明，采用的技术能够在任意公知的参考文献中找到，比如:Molecular Cloning(分子克 隆）：A Laboratory Manual(Sambrook,et al·，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology，Vol·185，edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA),"Guide to Protein Purification"in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)Innis,et al.1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transfer and Expression Protocols ,pp. 109-128,ed.E. J.Murray,The Humana Press Inc. ,Clifton,N.J.)，以及 the Ambion 1998Catalog(Ambion，Austin，TX)〇
[0040] 除非本申请另有明确地说明，本申请中使用的单数形式的"一(a)"、"一个(an)"和 "所述(the)"包括复数指代。本申请中使用的"和"能够也"或"互换使用，除非另有明确地说 明。
[0041] 本申请中使用的氨基酸残基采用如下缩写:丙氨酸(Ala;A)，天冬酰胺(Asn;N)，天 冬氨酸(Asp;D)，精氨酸(Arg;R)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酸(Glu;E)，谷氨酰胺(Gln;Q)，甘 氨酸(Gly;G)，组氨酸(His;H)，异亮氨酸（Ile;I)，亮氨酸(Leu;L)，赖氨酸(Lys;K)，蛋氨酸 (Met ;M)，苯基丙氨酸(Phe ;F)，脯氨酸(Pro ;P)，丝氨酸（Ser ;S)，苏氨酸(Thr ;T)，色氨酸 (Trp;W)，酪氨酸(Tyr;Y)和缬氨酸(Val;V)。
[0042] 本发明任意方面的所有实施例能够结合使用，除非本申请另有明确地说明。
[0043] 在第一方面，本发明提供了用于治疗口炎性腹泻的方法，包括给患有口炎性腹泻 的患者施用有效量的用于治疗口炎性腹泻的一种或多种多肽，所述一种或多种多肽包括选 自由下述组或其经加工的版本组成的组中多肽的氨基酸序列，或由选自由下述组或其经加 工的版本组成的组中的多肽的氨基酸序列组成。
[0044] 同源物1
[0045] MAPSDVEIVDPVAPEERITVTVLLRRRSSIPDQLIEGPDTLSRAELADRHGADPADVEAVRVAMSGAGLTVVGTDLP SRRVTVAGTAEALMRTFGAELQIVRDASGFQHRARSGELRIPAALDGIVIAVLGLDNRPQAEARFRASQPEAARSFR PDALGRVYRFPANTDGTGQTIAIVELGGGFRQSELDTYFGGLGIPAPQVLAVGVDGGQNLPSGDAGSADGEVLLDIE VAGALAPGARQVVYFAPNTDRGFVDAVTTAVHADPTPAAVSISWGAPEDKWTAQARRAFDAALADAAALGVTVTAAA ⑶RGSADGEGGGGLHTDFPASSPHLLACGGTKLAVADGGTVASETVWNGGERGGATGGGVSVAFGLPAYQRNAGVDK RRKTGKPGRGVPDVAAVADPATGYEVLVDGEQLVFGGTSAVAPLWAALVARLTQALGRPLGLLNTALYDGAQPGRTQ PGFRDVTEGDNDISGKHGPYPARAGffDACTGLGVPDGEALLAALRKPGKE(SEQ ID NO:74)；
[0046]同源物2 [0047] mqrgtkeglnmarhlqadreprivpeskclgqcdpaerihvumlrrqeegqldalvhqlatgdarakpvsrdafaq RFSANPDDIRKTEDFAHRHQLTVDRVDPVESVVVLSGT(I/V/D) AQFEAAFSVKLERFEHRSIGQYRGRSGPIVLPDDIGDAVTAVLGLDSRPQARPHFRFRPPFKPARGAAAVTFTPIQL ASLYDFPAGDGAGQCIAIIELGGGYRAADIQQYFRGLGITTPPKLVDVNVGTGRNAPTGEP(N/S/K/G) GPDGEVALDIEIAGAIAPAAKIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N)AGFIQAVNAAVTDKTNQPSVISISff(G/S) GPEAIffQAQSAQAFNRVLQAAAAQGITVCAASGD(S/N)GS(G/T/A)(D/N/G)GL(Q/D)DGADHV(D/S/H) FPASSPYVLGCGGTQLDALPGQGIRSEVTWNDEASGGGAGGGGVSALFDLPAWQQGLKVARADGTTTPLAKRGVPDV AGDASPQTGYEVSVAGTPAVMGGTSAVAPLWAALIARINAANGASAGWINPVLYKHPGALRDITKGSNGTYAAASGff DACTGLGSPNGAQLATILARKPSS(SEQ ID N0:95)；
[0048]同源物4
[0049] MANHPLNGSERECLKDAQPIGKADPNERLEVTMLVRRRSHDAFEKHISALAAQGASAKHIDHDEFTKHFGADSADLA AVHAFAQKHGLSVVESHEARRAVVLSGT(V/D) AQFDAAFGVSLQQYEHDGGTYRGRTGPIHLPDELNGVVDAVMGLDNRPQARPSFRTRAQGNVRWTARAAGASTFTPV QLASLYDFPQGDGQNQCIGIIELGGGYRPADLKTYFASL匪KAPSVTAVSVDHGRNHPTGDP(N/S/K/G) GPDGEVMLDIEVAGAVAPGAKIVVYFAP(N/D)(T/S)(D/A/T/N)AGFIDAIGTAIHDTKNKPSVISISff(G/S) GPE SAffTQQAMNAFDQAFQSAAALGVTICAASGD(N/S)GS(G/T/A)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H) FPASSPYALGCGGTSLQASGNGIASETVWNDGANGGATGGGVSSFFALPAWQEGLRVTRAGGAHSPLAMRGVPDVAG NADPVTGYEVRVDGHDMVIGGTSAVAPLWAGLIARINAIKGAPVGYINPHLYKDPLALVDITKGNNDDFHATAGWDA CTGLGRPDGKKVKDAVS(SEQ ID NO:75)；
[0050] 同源物5
[0051] MNHDHSPTGGELSNWVRVPGSERAAVQGSRKVGPADPNEQMSVTVVVRRPAADTAVTSMIEKVGAQPLSERRHLTRE EFASTHGANPADLSKVEKFAHEHNLQVKEVNAAAGTMVLSGT(V/D) TSFSKAFGVELSTYEHPDFTYRGRIGHVHIPDYLADTIQSVLGLDNRPQASPRFRVLKEEGGVTTAHAGRTSYTPLE VAALYNFPSIHCKDQCIGILELGGGYRPADLQTYFNGLGIPQPNITDVSVGGAANRPTGDP(N/S/K/G) GPDGEVVLDIEVAAAVTPGAKIAVYFAD(N/D)(S/T)(D/A/T/N)DGFLNAITTAIHDTRNKPSVISISff(G/S) KAEIGffTPQAINAMNQAFRDAAALGVTICCASGD(D/S/N)GS(T/A)(D//N/G)RV(Q/D)DGRYHV(D/S/H) FPASSPYVLACGGTRLESSGSTITQEVVWNEGALGGGATGGGVSDVFDRPNWQANANVPTSANPERRIGRGVPDWAG NADPATGYQILVDGTRAVIGGTSAVAPLFAGLIAIINQKLGHSVGFINPILYNLSAQHNVFHDITSGNNDMSGQNGP YEAQPGffDACTGLGSPDGTKLMNAISEAHRLVSVG(SEQ ID NO:76)；
[0052]同源物6 [0053] MAPEERRTLPGSAMPRPAGAQVLGQIPDDERVEVTVVLQPRAPLPEPGPTPMSRAELADLRSPPEGALEAIARYVAG QGLEVIAADAPRRRIVLAGSAARIAALFGISFVRLQLEGRRYRTYEGEISLPAELAPLVVAVLGLDTRPFARSHRRP AVAPNAPTTAPTVARAYDFPTAYDGRGTTIGFIELGGGFQESDLVRYCEGLGLSTPQVSWGVDGARNAPTCDPNGP DAEVMLDLEVATGVANGADLVLYMAANTDAAFYSAIATALRDATHAPVAISISWGAPEESYPATTIAAFESVLEEAV HVGVTVLVAAGDQGSTDGVDDGRAHVDYPAASPYVLACGGTRLDLDGTTIVAETVWNDLPNGGATGGGISALFPVPS WQAGIAMPPSANPGAGPGRGVPDVAGNADPDTGYRIVVDGVATVVGGTSAVAPLWAGLVARCHQAGARGGFffNPLLY AARGSSAFHEITVGSNGAYDAGPIWNACCGLGSPNGTAILQTLRA(SEQ ID NO:77)；
[0054]同源物6突变株
[0055] MAPEERRTLPGSAMPRPAGAQVLGQIPDDERVEVTVVLQPRAPLPEPGPTPMSRAELADLRSPPEGALEAIARYVAG QGLEVIAADAPRRRIVLAGSAARIAALFGISFVRLQLEGRRYRTYEGEISLPAELAPLVVAVLGLDTRPFARSHRRP AVAPNAPTTAPTVARAYDFPTAYDGRGTTIGFIELGGGFQESDLVRYCEGLGLSTPQVSWGVDGARNAPTCDPNGP DAEVMLDLEVATGVANGADLVLYMAANTDAAFYSAIATALRDATHAPVAISISWSAPEESYPATTIAAFESVLEEAV HVGVTVLVAAGDQGSTGGVDDGRAHVHYPAASPYVLACGGTRLDLDGTTIVAETVWNDLPNGGATGGGISALFPVPS WQAGIAMPPSANPGAGPGRGVPDVAGNADPDTGYRIVVDGVATVVGGTSAVAPLWAGLVARCHQAGARGGFffNPLLY AARGSSAFHEITVGSNGAYDAGPIWNACCGLGSPNGTAILQTLRA(SEQ ID NO:78)；
[0056] 同源物9
[0057] MTKQPVSGSSDKIHPDDAKCI⑶CDPSEQIEVIVMLRRKDEAGFRQMMSRIDAGEAPGQAVSREEFDRRFTASDEDI DKVKAFAKQYGLSVERAETETRSVVLKGT(I/V/D)EQFQKAFDVKLERFQHHNIGEYRGRTGPVNVPDEMHDAVTA VLGLDSKPQARPHFRFRPPFKPLRGAAPASFSPVDLAKLYDFPDGDGAGQCIAIIELGGGYRDSDLSAYFSKLGVKA PTVVPVGVDGGKNAPTGNP(N/S/K/G)GPDGEVTLDIEIAGAIAPGARIAVYFAP(N/D)(S/T)(D/A/T/N) AGFVDAVNRALHDAANKPSVISISff(G/S)GPESNWSPQSMSAFNDVLQSAAALGVTVCAASGD(G/S/N)GS(A/ T)(D/N/G)GV(G/Q/D)DGADHV(D/S/H)FPASSPYVLGCGGTSLAASGAGIAKEVVffNDGDQGGAGGGGVSGTF ALPVWQKGLSVTRNGKHIALAKRGVPDVAGDASPQTGYEVLIDGEDTVVGGTSAVAPLWAALIARINAIDASPAGFV NPKLYKAKTAFRDITEGNNGSFSAAAGffDACTGMGSPDGGKIAAALKPAKPSQSAGQQ(SEQ ID N0:79)；
[0058]同源物IO
[0059