免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法
【专利说明】免疫原性中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)组合物和方法
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年9月19日提交的美国临时申请No. 61 /880，111的权益，通过提及 将其完整收入本文用于所有目的。
[0003] 电子提交的文本文件的描述
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[0005] 发明背景
[0006] 冠状病毒能在动物(诸如人）中引起疾病。SARS(重度急性呼吸综合征)是此类疾病 的一个例子。最近，已经出现了一种新的冠状病毒，即中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，它与人死亡有关。MERS-CoV已经被世界卫生组织(WHO)鉴定为"威胁全球健康"，并且 已经在中东和欧洲的21个国家得到报告。MERS-CoV是一种高致病性呼吸系统病毒，其在受 感染的个体中引起重度呼吸窘迫和潜在的肾衰竭[1，2]。
[0007] 冠状病毒经由其在病毒体表面上的刺突（S)糖蛋白与其在宿主细胞上的关联受体 (例如二肽基肽酶4(DPP4)，其在多种人细胞上找到，包括肺和肾细胞)的相互作用附着于细 胞膜。S糖蛋白由含有受体结合域(RK))的N端Sl域和负责病毒-细胞融合的S2域组成。MERS-CoV RBD由核心域组成，所述核心域已经与人DPP4蛋白共结晶，这显示了它与DPP4的叶片 (blade)4和5相互作用[11]。在其它冠状病毒(包括SARS-CoV)中，针对RBD的抗体能够在体 外中和病毒并抑制病毒的生长[12-14]。在SARS-CoV的小鼠模型中，已经证明了疫苗诱导并 被动转移的中和性抗体有效抑制肺发病和死亡[15]。然而，已经报告了在体外人免疫细胞 中对SARS CoV的抗体依赖性增强(ADE)，尽管其在体内的临床意义是未知的。
[0008] 已经使用人康复期血浆和/或免疫球蛋白来有效预防和治疗许多病毒传染原
[16]。英格兰公共卫生部门（Public Health England)和国际重度急性呼吸系统和新兴感 染协会（International Severe Acute Respiratory&Emerging Infection Consortium) (ISARIC)将中和性抗体(包括康复期血浆）的被动免疫疗法鉴定为保证优先研究的MERS-CoV治疗方法。然而，生成具有高亲和力和亲合力抗体的大量抗病原体人血浆和/或免疫球 蛋白目前需要康复期患者的捐献，这会出于许多文化、基础设施和后勤原因而限制这些人 衍生产品的广泛利用度。需要快速生成特异性人多克隆免疫球蛋白以预防和治疗传染原 (包括MERS-CoV)的备选手段。
[0009] 发明概述
[0010] 本文中公开了用于刺激针对冠状病毒(CoV)感染的免疫应答的组合物和方法，所 述冠状病毒(CoV)引起中东呼吸综合征(MERS-CoV)。本公开内容提供了免疫原性并且针对 MERS-Co V感染提供保护的组合物。有利地，组合物诱导针对MERS-CoV的中和性抗体，并且可 以作为疫苗使用。
[0011] 本公开内容还提供了在对MERS-CoV易感的动物中诱导针对病毒感染的实质性免 疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的包含MERS-CoV纳米颗粒的疫苗。在一个实施 方案中，所述方法包括对动物口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用所述纳 米颗粒。
[0012]在各方面中，纳米颗粒仅含有一类MERS-CoV蛋白。在具体的方面中，唯一的蛋白是 刺突(S)蛋白。
[0013]在一个方面中，本公开内容提供了包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，其 中纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含所述刺 突多肽的至少约5个三聚体至约30个三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含所述刺突 多肽的至少约10个三聚体至约20个三聚体。在一个实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约 20yg/mL至约60yg/mL。在另一个实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约30yg/mL至约50yg/ mL。在又一个实施方案中，刺突多肽包含SEQ ID NO: 2。在还有又一个实施方案中，刺突多肽 由SEQ ID NO:2组成。
[0014] 在另一个方面中，本公开内容提供了生成高亲和力抗体的方法，其包括对动物施 用包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，其中所述纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个 三聚体，自所述动物收集血清和/或血浆，并自所述血清和/或血浆纯化抗体。在一个实施方 案中，所述方法进一步包括施用佐剂。在又一个实施方案中，佐剂选自下组:Montanide ISA 206、Quil A、明矾、弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、和氢氧化铝佐剂。在一个实施方案中，动物 是牛或马。在又一个实施方案中，牛或马动物是转基因动物。
[0015] 在一个实施方案中，通过用纳米颗粒免疫动物生成的抗体具有介于HT8和HT15之 间的KD。在又一个实施方案中，抗体具有介于约HT 12和HT14之间或介于约HT13和HT14之间 的KD。
[0016] 在还有另一个方面中，本公开内容包括对人受试者进一步施用经过纯化的通过所 述方法生成的高亲和力抗体。
[0017] 附图简述
[0018]图1显示了冠状病毒结构。
[0019]图2显示了通过实施本文中公开的方法获得的疫苗颗粒。
[0020] 图3显示了抗MERS抗体和抗SARS抗体分别对本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP 和SARS CoV纳米颗粒VLP的抗体结合。
[0021] 图4显示了本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的电子显 微照片。
[0022] 图5显示了在不同时间段，不同剂量，且在有和没有佐剂的情况中本文中公开的 MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的免疫方案。
[0023]图6显示了通过实施本文中公开的方法获得的疫苗颗粒。显示了 26nm蛋白质-蛋白 质胶束的三聚体中装配的MERS刺突蛋白。
[0024] 图7显示了在将本文中公开的MERS CoV VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP免疫入小鼠 中后的中和结果。基质M佐剂是尤其有效的。
[0025] 图8显示了经密码子优化的MERS CoV刺突核苷酸序列。
[0026] 图9显示了MERS CoV刺突氨基酸序列。
[0027]图IOA-C显示了MERS刺突蛋白特异性抗体生成和ELISA滴度。小图A显示了疫苗接 种策略(V记录疫苗接种编号;例如Vl是第一次疫苗接种，v2是第二次疫苗接种等）。小图B显 示了在免疫期里来自个别Tc动物的血清样品中的针对重组MERS-CoV刺突蛋白的抗体滴度， 如通过ELISA测量的。滴度数值(单位/ml)定义为0D450读数比空白高2.5倍时血清样品的最 高稀释度。小图C显示了 SAB-300和SAB-301中的针对重组MRS-CoV刺突蛋白的抗体滴度。滴 度活性数值(单位/mg)定义为0D450读数比空白高2.5倍时Img抗体的最高稀释度。
[0028]图IlA-B显示了来自荧光降低中和测定法的结果。小图A显示了通过FRNT5q测定法 对接种疫苗的牛血清测试中和。对于每份样品，将检出的MERS-CoV的50 %抑制需要的血清 质量(yg)制图。在用血清的稀释液预处理MERS-CoV后量化感染。在感染后，固定细胞，并用 抗刺突抗体标记以量化与假血清相比仅50 %细胞被感染的水平。小图B显示了 SAB-300和 3八8-301的?8阶5〇测定法结果，对348-300和348-301测定其在￥6仰细胞中抑制]\^1?-(：〇￥感染 的能力。在这些FRNT 5q测定法中使用抗原亲和纯化的家兔抗刺突抗体作为阳性对照。统计 学:非配对T检验及Welch氏校正，假设高斯分布。未发现显著性。棒是95 % CI。
[0029] 图12A-B显示了MERS-CoV中和测定法。小图A显示了通过以病毒滴度与阴性对照经 过纯化的hlgG相比的百分比绘图的TCID5q测定法对SAB-300和SAB-301测试其中和MERS-CoV 的能力。较高的百分比意味着较小的感染抑制。小图B显示了 SAB-300和SAB-301对MERS-CoV 的抗体依赖性增强。对感染后48小时来自与SAB-300和SAB-301预温育的MERS-CoV的RNA测 定MERS-CoV特异性转录物的量，并且以与假样品相比的倍数变化绘图。n.s.意指不显著的。 [0030] 图13Α-Β显示了在体内对MERS-CoV复制的抑制。在MERS-CoV感染前12小时将SAB-300以)或548-301(8)腹膜内转移入经4(15-110??4转导的841^/(3小鼠（6周，雌性）中。然后，用 I X IO5PFU MERS-CoV鼻内感染小鼠。在指定的时间点时测量肺中的病毒滴度。滴度以PFU/g 组织表示。11 = 3只小鼠/组/时间点。*与无处理组相比？〈0.05;与对照抗体组相比？〈0.05。 [0031]图14显示了MERS-CoV S蛋白与牛Tc衍生的人IgG的结合动力学。
[0032] 发明详述
[0033]应当理解，为了方便，贯穿本串请使用单数形式，诸如"一个"、"一种"和"该/所 述"，然而，除了在上下文或明确叙述另有指示的情况外，单数形式意图包括复数。此外，应 当理解，在此通过提及完整并且为了所有目的收录本文中提及的每篇期刊文章、专利、专利 申请、出版物、等等。所有数字范围应当理解为包括该数字范围内的每个和每一个数字点， 并且应当解读为个别叙述每个和每一个数字点。涉及组分或特性的所有范围包括相同端点 在内，并且意图是可独立组合的。
[0034] "约"包括与参照数值具有基本上相同的效果，或者提供基本上相同的结果的所有 数值。如此，由术语"约"涵盖的范围会随使用该术语的上下文(例如参照数值关联的参数） 而变化。如此，根据上下文，"约"可以意指例如± 15%、± 10%、±5%、±4%、±3%、±2%、 ±1%或±小于1%。重要地，前面有术语"约"的参照数值的所有叙述意图也是仅参照数值 的叙述。
[0035] 如本文中使用的，术语"杆状病毒"，又称为杆状病毒科，指节肢动物中的有包膜 DNA病毒的科，其成员可以作为用于在昆虫细胞培养物中生成重组蛋白的表达载体使用。病 毒体含有一个或多个杆状核壳，其含有一分子的环状超螺旋双链DNA(Mr 54 X 106_154 X 1〇6)。作为载体使用的病毒一般是苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒 (NVP)。引入基因的表达在强启动子的控制下，所述强启动子在正常情况下调节较大的核包 涵体的多角体蛋白组分的表达，在所述核包涵体中病毒包埋于受感染的细胞中。
[0036] 如本文中使用的，术语"自……衍生"指起源或来源，并且可以包括天然发生的、重 组的、未经纯化的、或经过纯化的分子。
[0037] 如本文中使用的，术语"大分子蛋白质结构"指一个或多个蛋白质的构建或排列。
[0038] 如本文中使用的，术语"疫苗"指用于诱导形成针对病原体的抗体或免疫力的死亡 的或减弱的病原体的，或衍生的抗原决定簇的制备物。给予疫苗以提供针对疾病的免疫力， 例如由MERS CoV病毒引起的MERS或由SARS CoV病毒引起的SARS。本公开内容提供了疫苗组 合物，其是免疫原性的，并且提供保护。另外，术语"疫苗"也指对脊椎动物施用以产生保护 性免疫力（即降低与感染有关的疾病的严重性的免疫力）的免疫原(例如纳米颗粒VLP)的悬 浮液或溶液。
[0039] 如本文中使用的，术语"实质性免疫力"指如下免疫应答，其中在对脊椎动物施用 纳米颗粒时，在所述脊椎动物中有免疫系统的诱导，这在所述脊椎动物中导致感染的防止、 感染的改善或至少一种与病毒感染相关的症状的减轻。
[0040] 如本文中使用的，术语"佐剂"指在配制剂中与特定免疫原（例如纳米颗粒VLPKi 合使用时加强或以其它方式改变或修饰所致免疫应答的化合物。免疫应答的修饰包括加强 或加宽抗体和细胞免疫应答任一或两者的特异性。免疫应答的修饰也可以意指降低或阻抑 某些抗原特异性免疫应答。
[0041] 如本文中使用的，术语"免疫刺激物"指经由身体的自身化学信使(细胞因子)增强 免疫应答的化合物。这些分子包括具有免疫刺激性、免疫加强性和促炎性活性的各种细胞 因子、淋巴因子和趋化因子，诸如白介素（例如11-1、几-2、11^-3、几-4、11^-12、几-13) ;生长 因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF));和其它免疫刺激性分子，诸如巨噬 细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1、B7.2,等等。免疫刺激物分子可以与纳米颗粒VLP在同一配 制剂中施用，或者可以分开施用。可以施用蛋白质或编码蛋白质的表达载体任一以产生免 疫刺激效果。
[0042] 如本文中使用的，"有效剂量"一般指足以诱导免疫力，防止和/或改善病毒感染或 减轻感染的至少一种症状和/或增强另一剂纳米颗粒的功效的纳米颗粒量。有效剂量可以 指足以将感染的发作延迟或最小化的纳米颗粒量。有效剂量也可以指在治疗或管理感染中 提供治疗益处的纳米颗粒量。此外，有效剂量是就单独或与其它疗法组合的纳米颗粒而言 在治疗或管理病毒感染中提供治疗益处的量。有效剂量也可以是足以增强受试者(例如人） 自身针对随后暴露于病毒的免疫应答的量。可以例如通过测量中和性分泌性和/或血清抗 体的量来监测免疫力水平，例如通过噬斑中和、补体结合、酶联免疫吸附、或微中和测定法 进行。在疫苗的情况中，"有效剂量"是预防疾病或降低症状严重性的剂量。
[0043]如本文中使用的，术语"实质上保护性抗体应答"指由脊椎动物(例如人)展现的， 防止或改善感染或者减轻其至少一种症状的由针对病毒的抗体介导的免疫应答。纳米颗粒 能刺激抗体的生成，例如中和性抗体，其阻断病毒进入细胞，通过结合病毒来阻断所述病毒 的复制，和/或保护宿主细胞免于感染和破坏。
[0044]如本文中使用的，术语"实质上保护性细胞应答"指由脊椎动物(例如人)展现的， 防止或改善感染或者降低其至少一种症状的由针对病毒的T淋巴细胞和/或其它白细胞介 导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉溶细胞性T细胞（"CTL"）的抗原特异性应答。 CTL对与由主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质联合呈递的 肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进胞内微生物的破坏，或者感染有此类微生物的细胞 的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助 刺激非特异性效应细胞的功能并且聚焦非特异性效应细胞的活性来针对在其表面上展示 与MHC分子联合的肽抗原的细胞。"细胞免疫应答"也指由活化的T细胞和/或其它白细胞(包 括那些自⑶4+和⑶8+T细胞衍生的）生成细胞因子、趋化因子和其它此类分子的生成。
[0045] 如本文中使用的，术语"以全群体为基础的实质性免疫力"指由于对群体中的个体 施用纳米颗粒所致的免疫力。所述群体中的所述个体中的免疫力导致预防、改善感染，或者 减轻与所述个体中的病毒感染