三叶因子2在制备治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物医学技术领域，具体涉及三叶因子2(TFF2)在制备治疗及预防呼吸 道病原体感染或其他因素造成的肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用。
【背景技术】
[0002] 呼吸道的急性炎症性疾病可见于呼吸道的感染、吸入高温、低温或有毒气体等，其 中呼吸道感染导致的急性炎症性疾病为常见，且以病毒性感染最为多见。
[0003] 呼吸道感染病原具有病原种类多、人群普遍易感、传播速度快、传染性强且不容易 控制等特点，一旦爆发严重威胁人类的健康。近年来，呼吸道病毒急性感染造成的疫情从未 间断，造成了大量的人员死亡和巨大的经济损失。2003年非典型肺炎冠状病毒(SARS-CoV) 的爆发，全球累计病例报告数超过8437例，其中死亡病例数达到813例，并造成了我国严重 的经济损失。2009年禽流感H1N1病毒再次席卷全球，截至2009年10月30日造成了全球190多 个国家和地区感染病例44万例，死亡达5712人。2013年3月新型重组禽流感病毒H7N9出现在 我国的长江流域，截至13年10月31日，中国内地确诊了 136例人感染H7N9禽流感病例，其中 死亡45人，随后散在的H7N9感染病例陆续被报道。最近几年，新中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV)从中东地区出现并呈现跨区域传播趋势，自2012年9月至今，已经有26个国家报 告了MERS-CoV病毒感染病例，全球有1626个感染者，已造成586个感染者死亡。这些数据充 分说明急性传染性呼吸道病原体感染能引发严重的疫情，其社会危害巨大，应当引起我们 的高度重视。
[0004] 人呼吸道急性病毒感染后，由于病原体复制而引发肺/支气管组织过度的炎症反 应，大量招募炎症细胞聚集在呼吸道组织，破坏了肺泡、气管/支气管和血管的正常组织结 构，造成了间质水肿和肺出血，称之为呼吸道窘迫综合征(ARDS)，这直接影响肺组织的正常 的气体交换过程，如果机体不能对损伤的肺组织及时修复的话，能很快的造成宿主死亡，所 以，呼吸道病毒感染发病率及死亡率一直居高不下，且每隔几年就发生一次疫情流行。而 且，这些病毒变异速度快，很容易产生耐药株，同时，呼吸道内的炎症应答阻碍了治疗药物 有效进入呼吸道组织，因而单纯的抗病毒药物治疗常常效果不佳。以流感为例，通过对不同 的季节性或流行性流感以及禽流感感染的研究发现，即使能够及时使用抗病毒药物，如奥 司他韦，虽然可降低重型流感的风险，但是并不能阻止大部分H5N1和H7N9重型感染患者的 死亡。而且，抗病毒药物治疗可导致耐药株病毒的出现。
[0005] 针对呼吸道急性病毒的大部分的策略是通过抗病毒药物来抑制病毒复制与播散， 从而达到改善预后的目的。然而，他们忽视了宿主因素的作用。研究表明，呼吸道疾病的严 重程度至少部分是由宿主因素决定的，许多感染病例的死亡是由与宿主炎症反应造成的不 可逆肺损伤所致。我们通过比较高致病性的禽流感病毒H7N9和低致病性的禽流感病毒H9N2 在不同时间点诱导的宿主反应来看，高致病性禽流感病毒诱导炎症反应启动慢(1天），然而 持续时间长(7天)且严重程度高;而低致病性的流感病毒能快速启动炎症反应(6小时），并 在第3天能及时终止炎症反应，表现出了精确的调控炎症反应的能力。提示，调节宿主的炎 症反应可能是一种易操控的、与抗病毒药物互补的治疗策略;与抗病毒药物相比，其对预防 耐药突变株的产生有优势；同时，对于尚无抗病毒药物的病毒感染(如MERS)，调节宿主的炎 症反应是唯一的治疗手段。因而，调节宿主的炎症反应具有广谱的治疗作用。
[0006] 在我们的研究中发现:三叶因子2(TFF2)是H9N2感染后高表达、H7N9感染高度抑制 的蛋白。提示该蛋白可能与炎症调节有关。TFF2于1982年由Jorgensen及其同事从猪胰腺中 分离出来，在不同物种中具有高度的保守性，人三叶因子2(hTFF2)和鼠三叶因子2(mTFF2) 含有同样的氨基酸数目，氨基酸序列的同源性达到82%。成熟的TFF2蛋白由106个氨基酸组 成，分子量约为7_12kD，内含4个外显子及两个对称的三叶结构域，因此其结构极其稳定，耐 酸、耐热且抗蛋白酶水解，主要表达在胃粘膜颈部杯状细胞中。之前的研究表明，TFF2主要 在胃肠道中发挥作用，其拥有胃肠道黏膜保护和上皮修复的功能，参与了胃癌的调节，减少 了细菌对肠道的损伤，保护了小鼠因 DSS肠炎而导致的致死。另外，TFF2在过敏反应中也发 挥重要作用，TFF2能减轻过敏反应，如缓解哮喘症状。其主要的作用机制不完全清晰，大体 包括与黏蛋白相互作用、促进细胞迀移、抗凋亡、抑制炎症反应等。然而，迄今为止，TFF2对 呼吸道急性炎症所引起的疾病的保护效果仍未知晓。本发明将着重解析TFF2在呼吸道急性 炎症性疾病中的抗炎症与组织损伤的修复功能。
【发明内容】
[0007] 本发明所解决的技术问题是:提供一种TFF2蛋白，利用该蛋白能降低肺组织炎症产生， 减少肺组织损伤，促进肺组织功能修复的优点，可用于制备治疗呼吸道病原体感染引起的 肺损伤的药物，该药物对流感感染引起的预后有明显的改善效果。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:提供一种三叶因子2在制备 治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物方面的应用，其中，所述三叶因子2的来源包括人 源、鼠源以及TFF2基因来源的多肽片段。
[0009] 所述的肺/支气管急性炎症疾病包括呼吸道病原体感染、吸入高温气体、吸入低温 气体、吸入有毒气体及上述多种因素混合造成的肺/支气管急性炎症疾病，以及急性炎症进 一步恶化的呼吸窘迫综合症、肺纤维化及迀延形成的慢性炎症。
[0010] 上述应用中，利用三叶因子2所制备的治疗及预防肺/支气管急性炎症疾病药物可 在肺/支气管急性炎症发生前预防性给药用以预防炎症发生或降低后续炎症的严重程度； 也可在肺/支气管急性炎症发生后作为治疗性药物给药以降低炎症与疾病的严重程度;也 可自肺/支气管急性炎症发生前至发生后连续或间隔给药，以获得更佳疗效。
[0011] 本发明的有益效果在于:与现有技术相比，本发明发现了TFF2蛋白的新用途，现有 技术表明TFF2蛋白能促进胃粘膜和肠粘膜修复，保护小鼠免于肠道细菌的攻击。本发明所 述TFF2蛋白分子能在流感病毒H7N9，PR8和H9N2感染以及LPS引起的呼吸道损伤中起保护作 用，减少发病率和死亡率，减轻呼吸道感染症状，可能在应对呼吸道新发病毒性感染的疫情 中起重要作用，尤其对预防与治疗尚无有效治疗药物的病毒性感染以及重症呼吸道感染尤 为有益，此外，TFF2蛋白在病毒感染中起保护作用并非通过抑制病毒复制，而是通过抑制炎 症反应，促进呼吸道粘膜组织修复，减少呼吸道组织损伤进行的。由于其他的呼吸道病原体 或理化因素引起呼吸道组织损伤的机理与流感病毒感染类似，因此，TFF2的保护作用并不 局限于流感病毒造成的呼吸道组织损伤，包括其他呼吸道病原体或理化因素引起的呼吸道 损伤，对参与呼吸道传染病疫情处理的疾控人员、参与火灾消防人员以及有毒气体处理的 专业人员进行预防性给药，可有效降低上述人员职业工作的风险以及受到的损害。
【附图说明】
[0012] 图1显示了流感病毒的攻毒模型（A)，H7N9和H9N2感染后小鼠的体重变化曲线 (B)，H7N9以及H9N2感染后小鼠的生存率曲线(C)。
[0013] 图2显示了这两株流感病毒感染后小鼠肺组织显著差异表达的基因(A)，芯片数据 中TFF2在不同时间点的表达情况（B)，荧光定量PCR验证肺组织中TFF2的表达（C)，以及 Western Blot验证TFF2在病毒感染的不同时间点的表达(D)。
[0014] 图3显示了TFF2真核表达载体pSVl · 0，pSVl · 0-TFF2，pSVl · 0-TFF2-6xHis的构建图 谱(A)，TFF2在体外细胞系的表达并被分泌到细胞上清中（B)以及TFF2-6xHis蛋白纯化在聚 丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上的验证(C)。
[0015] 图4显示了 TFF2蛋白处理对流感病毒H7N9，H9N2，PR8攻毒小鼠的保护模型（A)， TFF2上清提高H7N9感染小鼠的生存率，减少体重丢失(B)，TFF2蛋白减少H9N2感染造成的体 重丢失，而TFF2基因敲除小鼠加重了体重丢失以及延长体重恢复时间（C)，TFF2蛋白也保护 PR8感染小鼠，减少PR8感染造成的致死和体重丢失(D)。
[0016] 图5显示了 TFF2对流感病毒在小鼠体内（A)和在体外肺上皮细胞系A549(B)中对病 毒复制的影响，TFF2添加对H7N9感染小鼠肺组织显微结构的影响（C)以及炎性因子肿瘤坏 死因子a(TNF-a)和白介素6(IL_6)表达的影响(D);TFF2在脂多糖(LPS)诱导的急