球形芽孢杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方法及抗肿瘤应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物的提 取方法及抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002] 球形芽抱杆菌(Bacillus S地ae;ricus，Bs)，革兰氏染色呈阳性，是一种末端有膨 大的内生抱子囊的好氧细菌，其菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，并且闪着油脂样的光，菌 落为白色或淡黄色。球形芽抱杆菌的培养体有营养体期和芽抱期两个发育阶段，其中二元 毒素蛋白在其芽抱期产生。球形芽抱杆菌的细胞形态在不同发育阶段的形态有所不同。营 养体期细胞形态为杆状，周围有鞭毛，并且活动活跃。在芽抱期时，由于芽抱的形成使菌体 的末端膨大，呈鼓植状突起，待芽抱成熟，伴胞晶体被包在芽胞外膜内。不同的球形芽抱杆 菌的芽抱其形态和大小都不同。在球形芽抱杆菌生长时期，有些菌株会产生伴胞晶体，有些 不产生。伴胞晶体与杀蚊活性相关。所有的球形芽抱杆菌，由于缺乏=簇酸循环的中间酶导 致其不能代谢糖类物质，但是可W利用其它碳化合物作为碳源。球形芽抱杆菌在40°C生长， 生物素、硫胺素等生长因子能促进其生长。
[0003] 在芽抱形成时期两个蛋白相互作用折叠组成晶体，单独表达的BinA和BinB不能形 成伴胞晶体，只能形成无定形包含物。只有BinA蛋白对蚊虫有毒，但是毒力比较小。单独的 BinB对蚊虫无毒，但是能够增强BinA蛋白的毒力。只有它们同时存在，才能对蚊虫有较高的 毒性。Western-Blot实验表明BinA和BinB蛋白间没有交叉反应，说明运两个蛋白之间没有 同源性。一般认为，BinA决定毒素蛋白的杀蚊活性和特异性，而BinB主要与蚊幼虫的肠敏感 位点特异性结合。二者同时存在，才能发挥毒素蛋白的杀蚊毒性。
[0004] 生物毒素是由生物体产生并使其他生物体受到伤害或者致死的物质。生物毒素不 仅具有毒理作用，还具有药理作用。生物毒素也称为天然毒素，包括植物、动物、微生物所产 生的有毒物质。根据作用机理，运些毒素分为:细胞溶解霉素、直接作用于细胞、抑制蛋白质 合成、作用于离子通道、作用于细胞骨架、溶血或凝血的毒素等。生物毒素一般均有抗癌活 性，有些生物毒素对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，有些生物毒素抑制肿瘤的血管再生，从而 抑制肿瘤生长。
[0005] 微生物代谢产物包括毒素，在治疗和/或抑制肿瘤或在肿瘤辅助诊断、预后中有广 泛应用，包含球形芽抱杆菌2317-2的基因重组或组合物及其抗癌作用等生物活性，及其应 用上的基因重组或组合物、相关代谢产物、生物毒素的抑制/杀灭真菌、细菌、蚊虫、肿瘤细 胞等生物活性及其应用。然而，目前关于球形芽抱杆菌2317-2的胞外代谢产物的相关抗肿 瘤方面的研究未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方法及抗 肿瘤应用，经该提取方法分离纯化得到了球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物二元毒素晶体 蛋白，经证实该二元毒素晶体蛋白能够有效应用于抗肿瘤药物的制备中。
[0007] 本发明是通过W下技术方案来实现：
[0008] 本发明公开了一种球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物在制备抗肿瘤药物中的应 用，所述球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物为二元毒素晶体蛋白。
[0009] 所述二元毒素晶体蛋白是由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB组成。
[0010] 所述的药物为抗肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7或乳腺癌皿LA的药 物。
[0011] 所述的药物为促进肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤细胞增殖或抑制肿瘤细胞迁移的药 物。
[0012] 本发明还公开了上述的球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物的提取方法，包括W下 步骤：
[0013] 1)将球形芽抱杆菌2317-2在LB固体培养基上活化后，接种于LB液体培养基中，在 30°C下震荡培养过夜；
[0014] 2) Wl: 100的比例，将培养过夜的菌液转接入MBS培养基中，震荡培养至芽抱晶体 从菌株中完全释放，收集发酵液，离屯、取沉淀，将沉淀洗涂后重悬处理，然后在超声波处理， 直至晶体、芽抱及细胞碎片充分分散，震荡混匀，除去泡沫，离屯、，取沉淀；
[0015] 3)向沉淀中加水制成悬液，再加入溶菌酶，使悬液中溶菌酶的终浓度为0.1~ 0.2mg/ml，然后再37°C处理2~化，期间每30min取出轻柔混匀数次，然后离屯、收集沉淀；
[0016] 4)向沉淀中加入双蒸水制成悬液，然后加入50mM DTT充分混匀后，于27°C下静置 化，离屯、收集沉淀；
[0017] 5)将沉淀在-20°C下冻融，加入复方泛影葡胺溶液，混匀后离屯、，收集上清液，在无 菌水中透析后，低溫真空冷冻制得冻干粉，得到球形芽抱杆菌伴胞晶体蛋白，4°C保存。
[001引步骤2)所述洗涂采用0.5mol/L的NaCl;所述超声波处理是在4°C，20曲z，200W的条 件下处理25min，期间每破碎5s，停顿5s。
[0019 ]步骤4)是按Iml双蒸水中含有70mg沉淀的量向沉淀中加入双蒸水。
[0020]步骤5)中，加入质量浓度为42 %~44 %的复方泛影葡胺溶液，透析时间为24~ 4化。
[0021 ] 步骤2)、3)、4)及5)中所述的离屯、均是在8000~lOOOOr/min下，离屯、10~20min。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0023] 本发明公开了球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物一一二元毒素晶体蛋白在制备 抗肿瘤药物中的应用，通过球形芽抱杆菌2317-2菌株胞外代谢产物对人肿瘤细胞增殖的抑 制实验、对人肿瘤细胞调亡影响的实验W及对人肿瘤细胞迁移的影响实验，证实了该二元 毒素晶体蛋白具有特异性抑制肿瘤细胞生长的作用，因而能够有效应用于抗肿瘤药物的制 备中。实验结果显示:该球形芽抱杆菌2317-2提取的胞外代谢产物对肝癌细胞7721、肝癌细 胞7402、肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MC巧及乳腺癌细胞皿LA等肿瘤细胞均显示较好的抑制 作用，抑制率分别为:95%、75%、72%、64%、57%。本发明为寻找和发现新型的抗肿瘤药物 提供依据，拓展寻求发现抗肿瘤药物的范围，提出新的研究思路及新的研究领域。
[0024] 本发明还公开了球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物的提取分离方法，通过对该球 形芽抱杆菌2317-2的分批发酵，对其细胞进行裂解离屯、等处理，获得芽抱杆菌代谢产 物一-二元毒素晶体蛋白。该提取方法操作简单、对设备及环境要求低，经该方法提取分离 的晶体蛋白纯度局。该晶体蛋白是由二兀毒素组成的，由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB蛋白多肤组成，二者的同时存在才能形成伴胞晶体，缺一不可。
【附图说明】
[0025] 图1为球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物提取物作用不同时间对SMMC7721细胞的 抑制作用；
[0026] 图2流式细胞术检测球形芽抱杆胞外代谢产物对肿瘤细胞调亡的影响结果;其中， (a)为阴性对照组；（b)为0.167mg/mL组；（C)为0.25mg/mL组；（d)为0.375mg/mL组;Ql为坏死 细胞;Q2为晚调细胞;Q3为正常细胞;Q4为早调细胞；
[0027] 图始田胞划痕实验检测球形芽抱杆菌胞外代谢产物对肿瘤细胞迁移的抑制作用
[0028] 图4球形芽抱杆菌胞外代谢产物的不同浓度、不同作用时间对SMMC7721细胞迁移 的影响。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0030] 本发明所设及的球形芽抱杆菌2317-2菌株由中国科学院武汉病毒研究所馈赠，该 菌株为已知菌株，如在文献"Bei 化n,Haizhou Liu,et al.Mole州Iar Qiaracterization of a Glucokinase with Broad Hexose Specificity from Bacillus sphaericus S化ain C3-41[J]APPLI邸 AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGYJune2007，p.3581-3586。" 存在报道。
[0031] I、球形芽抱杆菌2317-2胞外代谢产物一一二元毒素晶体蛋白的提取
[0032] 球形芽抱杆菌胞外代谢产物包括二元毒素晶体蛋白分离纯化的方法为：
[0033] 首先在LB固体培养基上活化菌株后，接种于LB液体培养基中，3(TC震荡培养过夜； 第二天Wl: 100比例转接入MBS培养基中，震荡培养使芽抱晶体从菌株中完全释放;此时收 集发酵液，1000 Og离屯、IOmin;沉淀用0.5mol/L的NaCl离屯、洗涂一次后，重悬，超声波处理(4 °C，20k化，200W，破碎5sec，停5sec，共处理25min)，待晶体、芽抱和细胞碎片充分分散后，震 荡混匀，除去泡沫，离屯、，取沉淀;将沉淀加水制成悬液，按终浓度0 . Img/ml加入溶菌酶，37 °C处理化，每30min拿出来轻柔混匀数次，离屯、收集沉淀；按70mg沉淀/ml双蒸水制成悬液， 加入50mM DTT充分混匀后，静置于27°C处理化;离屯、收集沉淀;-20°C冻融一次，加入42%复 方泛影葡胺(泛影酸钢和泛影葡胺Wl :6.6比例配制），混匀后离屯、，使芽抱晶体纯度提高。 100(K)rpm离屯、20min，收集上清，并在无菌水中透析4她，检测可溶性晶体蛋白的浓度;低溫 真空冷冻条件下制成冻干粉，4°C保存。
[0034] 获得芽抱杆菌代谢产物一一二元毒素晶体蛋白，该晶体蛋白是由二元毒素组成 的，由等量的41.9kDa BinA和51.4kDa BinB蛋白多肤组成，二者的同时存在才能形成伴胞 晶体，缺一不可。
[0035] 2、肿瘤细胞培养及抑制率检测
[0036] 1)肝癌7721、肝癌7402、肺癌A549、乳腺癌MCF7、乳腺癌皿LA等细胞均购自美国 ATCC细胞库，于含10%胎牛血清的1640培养液中，置于37°C、5%C0播养箱中培养。
[0037] 2)接种:0.25%膜蛋白酶消化细胞，计数板计数后用相应的培养基(含10%胎牛血 清）制备细胞悬液，并W-定密度接种于96孔板中（乳腺癌细胞系MCF7,2X IO4个/孔、肺癌 细胞系A549，1.5 X IO4个/孔、宫颈癌细胞系化La，1.5 X IO4个/孔、肝癌细胞系肥L7402，3 X 1 〇4个/孔、肝癌细胞系SMMC7721，3 X 1 〇4个/孔、VSMC，2 X 1 〇5个/孔、皿VEC，3 X 1 〇4个/孔），体 积为18化L/孔。每组设5个平行孔。空白对照孔只加18化L/孔的培养基，不加细胞悬液。
[0038] 3)贴壁:培养板放在细胞培养箱中，培养2地，使细胞贴壁。
[0039] 4)给药:实验组加入待测药物20化，阴性对照组加入20化含溶剂的培养基，细胞培 养箱中培养作用4她。
[0040] 5)呈色：小屯、吸