一种椎间盘纤维环组织工程支架的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种椎间盘纤维环组织工程支架的制备方法，属于生物医学材料技术应用领域。
【背景技术】
[0002]椎间盘退变性疾病是当今社会中的一种常见疾病。在美国，仅次于上呼吸道感染而居第二位，是导致劳动力丧失的主要原因之一;亚洲国家如中国因为体力劳动者较多，发病率更高。随着我国老龄化进程的发展，椎间盘退变性疾病越来越成为严重影响人们工作生活的疾病。组织工程技术的出现为椎间盘疾病的治疗提供了新的思路和方法，有望为椎间盘修复或置换提供永久替代产品。其中，纤维环的再生修复是椎间盘组织工程首先要解决的问题，只有纤维环得到修复才能让髓核组织保持在椎间隙，进而对退变髓核实施下一步治疗。
[0003]近年来，用于构建纤维环组织工程支架的材料和方法研究较多。如静电纺丝纳米支架，虽然孔隙率高，但其力学性能是各向同性的，与天然纤维环不符，且其生产效率太低；取向性藻酸盐/壳聚糖复合支架，其力学性能与天然纤维环相差甚远;聚己酸内酯苹果酸三醇/脱钙骨基质明胶双相纤维环支架，双相支架的内外层结合不牢、容易脱落，且生物相容性差；国内徐宝山等用猪的纤维环脱细胞基质作为纤维环支架，存在的问题在于支架形状、大小、降解速率无法随意控制。因此，寻找新的纤维环组织工程支架材料和制备方法是椎间盘再生修复领域亟需解决的问题。
[0004]本发明所采用的材料配方为魔芋葡甘聚糖、明胶和纳米羟基磷灰石，均无毒性且具有良好的生物相容性。魔芋葡甘聚糖力学性能好，降解速率偏慢；明胶力学性能差，降解速率偏快;通过改变二者的配比，可以按需控制支架的降解速率。纳米羟基磷灰石在支架中起到增强相的作用。本发明采用卷膜法制备的纤维环支架，形状、尺寸可调，并且具有各向异性的结构特点和力学性能，能够满足纤维环抗一定张力的要求，在结构上具有高仿真性。本发明制备的纤维环由薄膜围绕特定的型芯卷制而成，孔隙率高，能够满足组织工程支架材料对孔径和孔隙率的要求。该支架在椎间盘再生修复领域具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是现有纤维环支架结构仿真度不高、降解速率不可控、力学性能不具备各向异性等问题。
[0006]本发明的目的在于提供一种椎间盘纤维环组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤:
(I)原液的配制:将魔芋葡甘聚糖、明胶、纳米羟基磷灰石溶于蒸馏水中制备得到原液，原液中魔芋葡甘聚糖浓度为10?50 g/L，明胶浓度为I?50 g/L，纳米羟基磷灰石浓度为η，O<n<20 g/L ο
[0007](2)制膜:将原液倒在特定的模板上，原液在重力的作用下流淌并平铺于模板上形成均匀薄层，薄层厚度为I?5 _，随后，将薄膜进行冷冻干燥或在温度低于60°C的干燥箱中干燥。
[0008](3)膜的交联:将干燥的膜浸入交联液中交联6?24 ho
[0009](4)初生纤维环的制备:将半湿状态下的膜切成条状，宽度为5?20mm，然后绕柱状型芯缠绕成环状。
[0010](5)纤维环的交联:用保鲜膜将初生纤维环连同型芯一起包裹好，固定防止散开(例如在外面用绳或其它物品固定)；然后再次浸入交联液中交联6?24 h，保鲜膜上留有孔洞，以使初生纤维环能够浸泡在交联液中。
[0011](6)纤维环支架的形成:将交联好的纤维环用蒸馏水反复浸泡、清洗，除去交联剂；然后将纤维环在-18?-40 °C的条件下冷冻24 h以上，之后对样品进行冷冻干燥直至样品水分完全挥发，得到干燥的椎间盘纤维环组织工程支架。
[0012]优选的，本发明所述原液的配制，具体包括以下步骤:将明胶加入蒸馏水中静置2?12h，然后水浴加热至40?70°C，充分搅拌至明胶完全溶解;然后加入纳米羟基磷灰石粉体，继续搅拌直至羟基磷灰石粉体在溶液中形成均匀悬浮状态，加入魔芋葡甘聚糖搅拌至魔芋葡甘聚糖与悬浮液充分混合，然后置于700W功率的微波炉中加热20?30s，加热完成后取出冷却至室温得到原液。
[0013]本发明所述交联剂可以是1%?28%质量浓度的氨水或0.1%?10%质量浓度的戊二醛。
[0014]本发明所述柱状型芯的横截面可以是任意所需的形状。
[0015]本发明制备的椎间盘纤维环组织工程支架横切面为同心环状，类似于自然纤维环，如图6所示。
[0016]本发明所述魔芋葡甘聚糖和明胶均属于天然高分子材料，无细胞毒性，具有良好的生物相容性，且来源广泛，价格低廉。魔芋葡甘聚糖力学性能好，降解速率偏慢；明胶力学性能差，降解速率偏快;通过改变二者的配比，可以按需控制支架的降解速率;适量添加的纳米羟基磷灰石在支架中起到增强相的作用；先将魔芋葡甘聚糖、明胶和纳米羟基磷灰石材料制备成薄膜。为了使薄膜具有一定的力学强度，首先要将其浸入交联液中进行交联。然后再将其切成长条状并绕任意横截面形状的柱状型芯缠绕成同心环状。由于层与层之间的结合力不强，初生纤维环需要再次浸入交联液进行后期的交联。魔芋葡甘聚糖在碱性溶液环境中可以发生脱乙酰基作用，从而产生交联，并且这种交联是热不可逆的，非常稳定；明胶在戊二醛溶液中会产生化学交联，交联点为化学键，性质稳定。利用魔芋葡甘聚糖和明胶的这一特性，交联剂选用碱液或戊二醛溶液。
[0017]本发明的有益效果:
(I)本发明所用原料魔芋葡甘聚糖、明胶和纳米羟基磷灰石均无细胞毒性，具有良好的生物相容性，并且通过改变魔芋葡甘聚糖和明胶的配比，使支架的降解速率可调。
[0018](2)本发明所述方法制备得到的椎间盘纤维环支架层厚可调，通过改变薄膜的厚度即可实现。
[0019](3)本发明所述方法制备得到的椎间盘纤维环支架形状可任意设计，通过改变型芯的形状即可实现。
[0020](4)本发明制备的纤维环支架是对天然椎间盘纤维环的高度仿真，具有各向异性的结构和力学特征，能够承受一定的压力和张力；另外，纤维环由多孔的薄膜卷制而成，因而具备较高的孔隙率，有利于细胞的黏附生长。
【附图说明】
[0021 ]图1为该椎间盘纤维环组织工程支架的制备工艺流程图。
[0022]图2为实施例1、2和3得到的纤维环支架的红外光谱图。
[0023]图3为实施例1、2和3得到的纤维环支架的粉末X射线衍射图。
[0024]图4为实施例2得到的纤维环支架的扫描电子显微镜照片。
[0025]图5为实施例3得到的纤维环支架的扫描电子显微镜照片。
[0026]图6椎间盘纤维环组织工程支架横切面图。
【具体实施方式】
[0027]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
[0028]实施例1
(I)原液的配制:将明胶加入蒸馏水中静置2h，然后水浴加热至50°C，充分搅拌至明胶完全溶解;然后加入纳米羟基磷灰石粉体，继续搅拌直至纳米羟基磷灰石粉体在溶液中形成均匀悬浮状态;加入魔芋葡甘聚糖搅拌至魔芋葡甘聚糖与悬浮液充分混合，搅拌速度为1300 r/min，时间为30min;然后置于700W功率的微波炉中加热20s，加热完成后取出冷却至室温得到原液;原液中魔芋葡甘聚糖浓度为30g/L，明胶浓度为25g/L，纳米羟基磷灰石浓度为15g/L。
[0029](2)制膜:将原液倒在特定的模板上，原液在重力的作用下流淌并平铺于模板上形成均匀薄层，薄层厚度为1_，随后，将薄膜在-30 °C的冰箱中冷冻4h，然后进行冷冻干燥。
[0030](3 )膜的交联:将干燥的膜浸入交联液中交联12h，交联液为浓度为25%的氨水。
[0031](4)初生纤维环的制备:将半湿状态下的膜切成条状，宽度为10mm，然后绕一型芯缠绕成环状;型芯形状为圆柱形，直径为8mm。
[0032](5)纤维环的交联:用保鲜膜将初生纤维环连同型芯一起包裹好，并在外面用绳捆绑固定，防止散开，然后再次浸入交联液中交联12h，保鲜膜上留有孔洞，以使初生纤维环能够浸泡在交联液中。
[0033](6)纤维环支架的形成:将交联好的纤维环用蒸馏水反复浸泡、清洗，除去交联剂，然后将纤维环在-30°C的条件下冷冻25h，之后对样品进行冷冻干燥直至样品水分完全挥发，得到干燥的椎间盘纤维环组织工程支架。
[0034]本实施例制备得到的椎间盘纤维环组织工程支架的红外光谱图如图2所示，由图可以看出，样品在波数为1042 cm_1,605 cm—1和564 cm—1处出现的吸收峰对应于P043—中P_0键的非对称伸缩振动峰，说明材料中存在羟基磷灰石相。样品在波数为805 cm—1和878 cm—1处出现的吸收峰对应于甘露糖的特征吸收峰，说明样品中KGM的一级形态保持完整。样品在1650 cm—1和1550 cm—1处附近均出现了酰胺Π键的吸收峰，说明样品中胶原分子的一级结构保持完整。
[0035]本实施例制备得到的椎间盘纤维环组织工程支架的X射线衍射图如图3所示，由图可以看出，样品在20 = 31.77°，29 = 32.20° , 2Θ = 32.90°，2Θ = 35.48°对应的是羟基磷灰石的(211)，( 112)，(300)，(301)晶面的衍射峰。
[0036]实施例2
(I)原液的配制:将明胶加入蒸馏水中静置5h，然后水浴加热至60°C，充分搅拌至明胶完全溶解;然后加入纳米羟基磷灰石粉体，继续搅拌直至纳米羟基磷灰石粉体在溶液中形成均匀悬浮状态;加入魔芋葡甘聚糖搅拌至魔芋葡甘聚糖与悬浮液充分混合，搅拌速度为1400r/min，时间为40min;然后置于700W功率的微波炉中加热22s，加热完成后取出冷却至室温得到原液;原液中魔芋葡甘聚糖浓度为25g/L，明胶浓度为30g/L，纳米羟基磷灰石浓度为20g/L。
[0037](2)制膜:将原液倒在特定的模板上，原液在重力的作用下流淌并平铺于模板上形成均匀薄层，薄层厚度为3_，随后，将薄膜在50 0C的干燥箱中干燥。
[0038](3)膜的交联:将干燥的膜浸入交联液中交联6h，交联液为浓度为10%的戊二醛。
[0039](4)初生纤维环的制备:将半湿状态下的膜切成条状，宽度为12mm，然后绕一型芯缠绕成环状;型芯形状为圆柱形，直径为9mm。
[0040](5)纤维环的交联:用保鲜膜将初生纤维环连同型芯一起包裹好，并在外面用绳捆绑固定，防止散开。然后再次浸入交联液中交联8h。保鲜膜上留有孔洞，以使初生纤维环能