一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，属于药物筛选技术领域。
【背景技术】
[0002]胃肠道是人体最大的免疫器官，也是人体最大的排毒器官。胃肠道指的是从胃幽门至肛门的消化管。肠是消化管中最长的一段，也是功能最重要的一段。自改革开放以来，随着经济的高速发展，社会竞争的日趋激烈，人们生活节奏的加快和工作压力的增大而导致的胃肠道类疾病问题日渐普遍。截止目前为止，该类疾病已成为临床的常见病和多发病，总发病率约占总人口的20 %左右;年龄越大，该类疾病的发病率越高，且男性高于女性，如不及时治疗，长期反复发作，胃肠道类疾病极易转化为癌肿。胃肠类疾病历来被医家视为疑难之症，该类疾病越早被发现，患者的治愈率也将越高。因此以快速且有效的方法对活体模式生物的胃肠道进行特异性标记，将有助于胃肠道类疾病的早期诊断和特效药物的研发，也具有非常重要的社会效益和广阔的市场前景。
[0003]目前在人口健康领域应用最广泛的模式生物包括噬菌体、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等。其中由于噬菌体、秀丽隐杆线虫和果蝇等模式生物与人类的亲缘关系较远；在基因水平及组织器官构成等方面，它们与人类也有着较大的差距；因此通常不利用以上三种模式生物作为实验动物对胃肠道进行研究。小鼠是一种小型啮齿类的哺乳动物，虽然在进化上与人类的距离较近，且解剖结构和发育过程等也与人类接近。但是由于小鼠属于体内受精、体内发育，且繁育周期较长。因此以其作为实验动物对胃肠道进行特异性标记及研究时，通常费时费力。小鼠胃肠道被特异性标记后，其结果的观察只能是将实验动物处死后，在体外进行;或是利用影像技术间接观察活体小鼠的胃肠道。以上过程均周期较长且成本较高，实验结果缺乏直观性。
[0004]中国专利文献CN103301480A(申请号201310181252.4)公开了一种斑马鱼肠蠕动模型的建立方法及筛选促胃肠动力药物的方法，包括(I)斑马鱼选取；(2)模型诱导及化合物处理；(3)荧光显微镜定量分析。该方法选择斑马鱼作为实验动物，利用尼罗红作为染料标记其胃肠道。但是该方法优选的标记时间为16h，整个实验周期较长。
[0005]鉴于以上研究方法的不足，建立一个可快速、特异性对活体模式生物胃肠道进行标记的方法;使得既缩短实验周期、降低研究成本，又能增加实验结果观察的可靠性和直观性是目前亟待解决的技术难题。
[0006]斑马鱼(Dan1rer1)是源自印度、巴基斯坦淡水河流中的一种小型热带淡水鱼，属于鲤科，是生命科学领域的重要脊椎动物之一，现已被美国国家卫生研究院列为继人和小鼠之后的第三大模式生物。在基因组水平上，斑马鱼与人类具有高达87%的同源性，约70%的人类基因在斑马鱼中至少有一个明显的同源基因。在生理结构、信号通路传导和蛋白质功能等方面，斑马鱼与人类相比也表现出很高的保守性。与小鼠相比，斑马鱼体外受精、体外发育、胚胎透明，整个发育过程清晰可见，且产卵量高，发育周期短。因此以斑马鱼作为实验动物对胃肠道进行特异性标记及研究，既经济又快速，且结果直观，易于观察。
[0007]在胃肠道的细胞功能和解剖结构等方面，斑马鱼与人类非常相似，均由内皮细胞、结缔组织、环状肌和外纵肌组成。斑马鱼胚胎发育至26-126hpf，其肠道的管腔形成，并不断生长，功能性肠道上皮由内胚层逐渐分化形成。斑马鱼胚胎发育至72hpf，在未喂食状态下，其肠道首次出现不稳定的自发性收缩。伴随着胚胎发育的进行，至120-144hpf，斑马鱼胚胎的大部分卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强。由于斑马鱼胚胎体外发育且透明，因此在早期发育阶段，其胃肠道均易于观察。
[0008]钙黄绿素又名3，3’_双(甲胺二乙酸)荧光素。它是一种荧光指示剂，常用于络合滴定钙，也可用于检测镍、锶、铜、钡、钼、锰等元素。由于钙黄绿素具有很低的细胞毒性，且不会抑制任何的细胞功能，因此是一种常用的活细胞荧光染料。
【发明内容】
[0009]本发明针对现有技术的不足，提供一种利用钙黄绿素作为荧光标记物特异性标记斑马鱼胃肠道的方法。本发明可以在不对模式生物造成机械伤害和强烈应激反应伤害的前提下，对活体动物的胃肠道进行快速且特异性的标记。
[0010]为实现本发明的目的，发明人提供如下技术方案:
[0011 ] 一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，步骤如下:
[0012](I)挑选受精120?144hpf发育正常的斑马鱼胚胎，放入含有培养液的培养容器中，加入钙黄绿素溶液，调钙黄绿素的质量浓度为0.15%?0.25% ;
[0013](2)在23°C?27°C的恒温条件下避光孵育斑马鱼胚胎9?llmin，然后用培养液清洗，制得标记后的斑马鱼胚胎；
[0014](3)将步骤(2)制得的标记后的斑马鱼胚胎麻醉，利用图像采集工具，对斑马鱼胚胎中显示黄绿荧光的胃肠道部分进行影像采集并保存。
[0015]根据本发明优选的，所述步骤(I)中，所述斑马鱼胚胎为健康野生型AB系斑马鱼胚月台O
[0016]根据本发明优选的，所述步骤(I)中，斑马鱼胚胎为受精144hpf发育正常的斑马鱼胚胎。
[0017]根据本发明优选的，所述步骤(I)中，培养容器为标准规格的细胞培养板;进一步优选的，所述培养容器为标准规格的6孔或12孔细胞培养板。
[0018]根据本发明优选的，所述步骤(I)中，所用钙黄绿素溶液的质量浓度为0.2%。
[0019]根据本发明优选的，所述步骤(I)和(2)中，所述培养液为胚胎培养水，包括如下组分:
[0020]NaCl 5mM，KCl 0.17mM,CaCl2 0.4mM,MgS04 0.16mM，去离子水配制。
[0021]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，避光孵育的恒温条件为25°C。
[0022]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，避光孵育斑马鱼胚胎的时间为lOmin。
[0023]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，培养液清洗次数为2?3次。清洗2?3次后培养孔中看不到钙黄绿素的黄绿色荧光。
[0024]根据本发明优选的，所述步骤(3)中，麻醉采用的麻醉剂为三卡因(tricaine，ethyl3-aminobenzoate methanesulfonate)。
[0025]根据本发明进一步优选的，上述麻醉剂的使用质量浓度为0.02%。在该麻醉剂的浓度下，斑马鱼胚胎完全进入麻醉状态，便于结果观察。
[0026]根据本发明优选的，所述步骤(3)中，影像采集工具为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
[0027]有益效果
[0028]1、本发明首次利用钙黄绿素作为荧光标记物对斑马鱼胃肠道进行标记，该标记物安全可靠、毒性极低，可以在不对活体模式生物造成机械伤害或强烈应激反应伤害的前提下，对胃肠道进行快速且特异性的标记；
[0029]2、本发明首次对钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的影响因素进行了研究，发现对钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的影响因素与在骨骼沉积等方式进行染色的影响因素不相同，通过对相关条件进行优化后，获得了能够得到胃肠道轮廓清晰、清楚可见、易于辨识的结果的标记方法；
[0030]3、本发明所述的一种采用钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道的方法，具有操作快速、简便、稳定可靠、成功率高和重复性好等优点，可使活体模式生物胃肠道的观察更为直观、便捷，提高胃肠道类药物研发的准确性和可靠性。
[0031]4、本发明选择发育至120_144hpf的斑马鱼胚胎，其大部分卵黄囊被吸收，肠道自发的蠕动及摄食能力增强;将此发育阶段的斑马鱼胚胎暴露于钙黄绿素溶液中，活体胚胎的胃肠道可被钙黄绿素特异性标记，发出绿色荧光，整个胃肠道轮廓清晰，易于辨认。
【附图说明】
[0032]图1为不同浓度钙黄绿素标记斑马鱼胃肠道后荧光显微镜下的照片；
[0033]图中:A为空白对照组的照片，方框中标记