一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种疫苗纳米乳佐剂及其制备方法和用途，特别涉及一种用于猪牛口 蹄疫疫苗的双相纳米乳佐剂及其制备方法和用途，本发明属于兽医学领域。
【背景技术】
[0002] 纳米科技是20世纪80年代末期诞生并正在迅速崛起的新兴边缘学科，由于纳米微 粒具有小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等特点，能产生许多不同 于常规物态所具有的新奇特性，显示出非常广阔的应用前景。因此，应用纳米技术和材料开 发靶向、控释药物，已经成为现代生物制品学的研究热点。近年来，纳米材料在医学免疫领 域，特别在疫苗佐剂方面受到了极大的重视，与传统油佐剂、氢氧化铝佐剂相比，纳米化佐 剂与抗原物质结合具有更大的结合表面积，可在同等体积下容纳更多的抗原，并借助其在 水相中的均匀性，可使抗原更不易被降解破坏，提高了接种抗原的利用率。其次，由于纳米 佐剂的均质性优于传统佐剂，可将具有抗原递呈能力的巨噬细胞、树突状细胞等集中在一 定区域，使包裹、吸附或结合有抗原表位的纳米微粒更有效地被抗原递呈细胞吞噬、加工、 递呈，在短时间内激活免疫应答，显著提高机体免疫反应的水平。在副作用方面，因纳米微 粒的利用率极高，使其使用剂量及其副作用显著降低。更重要的是由于纳米佐剂是将抗原 包裹于纳米粒子内部或吸附在其表面，或通过化学连接作用与纳米粒子结合，从而可持久 地释放被包裹的抗原，其控制释放效果更为理想。
[0003] 我国在兽类疫苗生产佐剂使用方面，最常用的是矿物油佐剂蒙特耐得 (Montnanide) ISA 206，因为它的如下优越性:第一内溶成分比较特殊，在与水相的混和乳 化中不需再添加其他乳化剂即可与水相结合成稳定的乳剂;第二在油水相混和乳化过程中 对硬件设备要求较低。但随着疫苗质量标准的不断提高，其缺点不断突显，在动物体内不能 被代谢，毒性较大，注射到动物体内会在注射部位局部形成小结、肉芽肿，有些动物甚至会 形成无菌性化脓性炎症反应，而且不能实现隔离、保护、控制释放、靶向释放等多种功能的 作用，因此本发明针对上述问题将纳米科技和W/0/W技术相结合研制获得一种新型佐剂，主 要目的是研究一种稳定性良好、安全性高、成本低且易产业化生产的新型纳米乳佐剂来替 代传统佐剂，为提高防控猪牛等家畜口蹄疫疾病的水平和效率提供新的技术手段。
【发明内容】
[0004] 面对当前养殖业特别是猪、牛等家畜口蹄疫疫病暴发和流行以及疫苗免疫持续期 短，过敏反应等难以控制的严峻形势，本发明提出了一种适用于猪牛口蹄疫疫苗的新型水 包油包水型(W/0/W)双相纳米乳佐剂，其具有安全性高、疫苗副作用小，抗原缓释能力强等 特点，本发明的提出为提高防控猪牛等家畜口蹄疫疫病的水平和效率提供了新的技术手 段。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0006] 1、纳米乳佐剂配方的筛选
[0007] 通过绘制伪三元相图及正交试验设计，筛选出空白纳米乳配方。
[0008] 2、口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的制备
[0009] 在15~25°C条件下，按照筛选的空白纳米乳配方，用该佐剂与口蹄疫灭活抗原乳 化配制疫苗。
[0010] 3、口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的质量评价
[0011] (1)微观形态:在透射电镜下观察口蹄疫纳米乳佐剂疫苗的微观形态。
[0012] (2)粒径分布:用激光粒度分析仪测定其平均粒径及强度粒径分布。
[0013] (3)黏度测定：
[0014] 方法一:取出lml玻璃吸管（下口内径为1.2mm，上口内径为2.7mm)，在25°C环境中 吸取纳米乳剂lml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，测定三次，取平均值。
[0015]方法二:转子型黏度计法:动力黏度n(Pas) = κ (Τ/ ω )，其中κ表示已知黏度的标准 液测得的旋转式黏度计常数，Τ为扭力矩，ω为角速度。
[0016] (4)离心检测：吸取口蹄疫纳米乳佐剂疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心 30min，观察是否有水相析出及分层现象出现。
[0017] (5)稳定性检测：取3批制备好的□蹄疫纳米乳佐剂疫苗分别在4°C放置1年、20°C 放置6个月、37°C放置1个月，观察纳米乳佐剂疫苗的外观。
[0018] 4、安全性试验
[0019] 5、纳米乳佐剂疫苗对小鼠的免疫效力试验
[0020] 6、纳米乳佐剂疫苗对猪的免疫效力试验 [0021] 7、纳米乳佐剂疫苗对牛的免疫效力试验 [0022] 8、该纳米乳疫苗1000L体系的工艺放大
[0023]在上述研究的基础上，本发明最终筛选得到了一种用于猪牛口蹄疫疫苗的双相纳 米乳佐剂，所述的双相纳米乳佐剂由表面活性剂、助表面活性剂以及油相组成；
[0024]其中，所述的表面活性剂选自TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯、 Span80中的一种或两种以上的组合；
[0025]其中，所述的助表面活性剂选自聚丙醇、PEG 400或二者的组合；
[0026] 其中，所述的油相选自麦芽油、液体石蜡、花生油中的一种或两种以上的组合；
[0027] 其中，所述的表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1-4,表面活性剂与助表面 活性剂的混合物与油相的质量比为1 -1 〇: 〇. 1 -1 〇。
[0028]在本发明中，优选的，所述的表面活性剂为TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双 油酸酯以及SpanSO的混合物，其中TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及 Span80的质量比为3:1-3:1:1;所述的助表面活性剂为聚丙醇以及PEG400的混合物，其中聚 丙醇以及PEG 400的质量比为1:1;所述的油相为液体石蜡。
[0029] 在本发明中，优选的，所述的表面活性剂与助表面活性剂的质量比为7:1-4,所述 的表面活性剂与助表面活性剂的混合物与油相的质量比为3-5:5-7。
[0030] 在本发明中，优选的，所述的表面活性剂为TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双 油酸酯以及SpanSO的混合物，其中TweenSO、油酸聚氧乙烯酯、聚氧乙烯双油酸酯以及 Span80的质量比为3: 2:1:1;所述的助表面活性剂为聚丙醇以及PEG 400的混合物，其中聚 丙醇以及PEG 400的质量比为1:1;所述的油相为液体石蜡，其中，表面活性剂与助表面活性 剂的质量比为7:1，表面活性剂和助表面活性剂混合物与油相的质量比为4:6。
[0031] 进一步的，本发明还提出了所述的双相纳米乳佐剂在制备猪牛口蹄疫纳米乳佐剂 疫苗中的用途。
[0032] 再进一步的，本发明还提出了一种猪牛口蹄疫纳米乳佐剂疫苗及其制备方法，所 述的纳米乳佐剂疫苗含有本发明所述的双相纳米乳佐剂以及口蹄疫病毒抗原液，其由以下 步骤制备得到：
[0033] (1)将本发明任一项所述的双相纳米乳佐剂采用121°C高温高压灭菌30min，冷却；
[0034] (2)在300-400rpm的转速下，将口蹄疫病毒抗原液以10-20g/min的流速加入到步 骤(1)的佐剂中；
[0035] (3)15-25Γ下，乳化15-25min即得。
[0036] 其中，优选的，口蹄疫病毒抗原液与双相纳米乳佐剂的质量百分比分别为45%和 55%〇
[0037] 相较于现有技术，本发明的有