核酸偶联物、其制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物制剂与临床药学领域，具体而言，涉及一种核酸偶联物、其制备方 法及其应用。
【背景技术】
[0002] 世界癌症报告Gl〇b〇can2013的数据显示，我国每年新发癌症病例282万例，因癌症 死亡病例196万例，预计到2020年，每年新发和死亡癌症病例将达到388万例和276万例。恶 性肿瘤的治疗始终是医药学领域研究的热点与难点。随着生命科学的飞速发展，科技的不 断进步，人们对生命体的认识越来越深入，通过对各类疑难杂症在基因水平上进行治疗使 医学发生了革命性的变化，给患者带来福音。基因治疗作为一种新兴的治疗手段，己经成为 当今医药学领域研究的前沿。
[0003] 当前，RNA干扰技术已经被广泛用于肿瘤、病毒感染、乙型肝炎以及肿瘤等多种疾 病的治疗。作为RNA诱导沉默复合体的主要成员，siRNA是RNA干扰的效应分子，可在体内诱 导进而产生RNA干扰效应，激发与之互补的目标mRNA沉默。但是裸siRNA在体内容易被核酶 (RNase)所降解，且半衰期短，转染效率低。因此，如何解决裸s iRNA在体内的稳定性问题使 之免受核糖核酸酶降解，显得尤其重要。另外，siRNA需要借助载体才能进入细胞发挥治疗 作用，因此设计开发转染效率高的siRNA传送体系，以提高siRNA的入胞能力同样非常重要。
[0004] 细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides，CPPs，又称穿膜肽）的发现为克服细胞 膜屏障带来了希望。它是一大类由10~30个氨基酸组成的短肽，也称为蛋白质转导域或"特 洛伊木马"肽或转导肽等。这些肽分子不会产生细胞膜永久性损伤，并且毒性低。到目前为 止，已发现了多种穿膜肽，它们共有的性质:①具有净正电荷性和两亲性;②穿膜转运效率 高;③可以导入近乎所有的细胞;④可以携带多种活性物质进入细胞;⑤可以通过固相合成 或原核表达制备，方法成熟简便。当前穿膜肽介导的核酸类药物递送的方法可以分为两种： 一是通过穿膜肽表面的正电荷与核酸表面的负电荷之间的静电相互作用，形成穿膜肽与核 酸类药物的物理共混物。二是通过共价键使穿膜肽与核酸类药物形成小型、单体的穿膜肽-s iRNA共价偶联物。
[0005] 第一种方法是一种将siRNA通过静电作用与穿膜肽结合简单有效的方法，需要过 量的穿膜肽才能与siRNA形成穿膜肽/siRNA复合物。如在形成寡聚精氨酸/siRNA复合物时， 精氨酸肽段和siRNA的混合比例为电荷12:1，摩尔比为56:1;使用MPG肽段时，电荷比为10: 1，摩尔比是84:1。但采用非共价结合的复合物时，大量的阳离子穿膜肽可能与细胞中负电 分子发生非特异性的相互作用或者将胞外的负电分子带入胞内而引起副作用。
[0006] 第二种方法是目前认为传递siRNA最有潜力的方法，可得到可溶性单体的siRNA偶 联物。但是，由于带有正电的细胞穿膜肽与带有负电的siRNA易于凝结使得这种方法难以利 用，如何避免两者之间通过静电作用形成非共价的复合物是合成的关键。目前应用比较广 泛的是二硫键和硫酯键。由于穿膜肽的核定位特性和RNA诱导沉默复合体机制的细胞质定 位特性，使得连接穿膜肽与siRNA分子的共价键在细胞环境内必须是可逆的。而以二硫键共 价连接形成的偶联物在细胞基质内可被分解，释放出连接物。因而使用穿膜肽与siRNA所形 成的特定的二硫共价键偶联物，是最佳的穿膜肽介导siRNA递送的方式。二硫键可由穿膜肽 上的甘氨酸和外源物质的巯基来形成，一些不含有巯基的外源物质则可使用化学修饰来添 加疏基，形成^硫键。
[0007] 虽然通过共价偶联SiRNA是递送SiRNA的最佳方式，但目前只有极少数描述SiRNA 与穿膜肽通过二硫键共价偶联的报道。而在已有的报道中，siRNA与穿膜肽两者间因静电作 用发生聚集、沉淀的问题也未得到较好的解决。因此，如何有效解决上述技术问题成了诸如 siRNA之类的核酸药物传递研究中的当务之急。
【发明内容】
[0008] 本发明的主要目的在于提供一种核酸偶联物、其制备方法及其应用，以解决现有 技术中核酸类药物在细胞内容易聚集发生沉淀的问题。
[0009] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种核酸偶联物，该核酸偶联 物的分子式为X-Y-B，其中，X为穿膜肽，Y是与X共价连接的柔性链段，B是与Y共价连接的核 酸药物。
[0010] 进一步地，柔性链段是由中性聚合物形成的线性结构的链段。
[0011]进一步地，柔性链段由聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯酰胺中 的任意一种中性聚合物形成。
[0012] 进一步地，中性聚合物的分子量为1000~10000,更优选为2000~5000。
[0013 ]进一步地，B与Y共价连接的共价键包括二硫键、腙键、酰胺键、酯键或醚键。
[0014] 进一步地，穿膜肽选自如下任意一种:序列号为SEQ ID N0:1的LMWP、序列号为SEQ ID N0:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID N0:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID N0:4的CAI、 序列号为SEQ ID N0:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID N0:6的MAP、序列号为SEQ ID N0:7的 MPGa、序列号为SEQ ID N0:8的M918、序列号为SEQ ID N0:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO: 10的penetratin、序列号为SEQIDN0:ll的P印-1-K、序列号为SEQIDN0:12的ARFl-22、序 列号为SEQ ID NO: 13的TplO、序列号为SEQ ID NO: 14的P0D、3~100个赖氨酸残基组成的聚 赖氨酸以及4~9个精氨酸残基组成的聚精氨酸;优选聚精氨酸为8个精氨酸组成的聚精氨 酸R8。
[0015] 进一步地，核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的 寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核 苷酸选自锁核酸、s i RNA、mi croRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗0DN、催化性RNA以及CpG二核苷 酸中的任意一种;更优选寡聚核苷酸为长度为19~23bp的siRNA。
[0016] 进一步地，19~23bp的siRNA为SEQ ID NO: 17至SEQ ID NO:172中的任意一种。
[0017] 进一步地，核酸偶联物的给药途径为静脉注射、皮下注射、黏膜给药或者经皮给 药;黏膜给药包括鼻腔黏膜、口腔黏膜、直肠黏膜和阴道黏膜中的任意一种。
[0018] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种上述核酸偶联物的制备 方法，制备方法包括:穿膜肽的活化步骤，将穿膜肽的N端或C端特异性地与中性聚合物进行 共价结合，得到活化的穿膜肽;核酸药物的活化步骤，在核酸药物反义链的3'端或者正义链 的任意一端引入不同于磷酸基团或羟基基团的反应活性基团，得到活化的核酸药物；以及 共价连接步骤，活化的穿膜肽与活化的核酸药物通过亲核反应或亲电加成反应得到核酸偶 联物。
[0019] 进一步地，中性聚合物为包括聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯以及聚丙烯 酰胺;优选中性聚合物的分子量为1000~10000,更优选为2000~5000。
[0020] 进一步地，反应活性基团包括氨基、巯基、羧基、马来酰亚胺基和N-羟基琥珀酰亚 胺基中的任意一种。
[0021] 进一步地，穿膜肽选自如下任意一种:序列号为SEQ ID N0:1的LMWP、序列号为SEQ ID N0:2的Tat48-60、序列号为SEQ ID N0:3的Tat48-60-P10、序列号为SEQ ID N0:4的CAI、 序列号为SEQ ID N0:5的HIV-TAT、序列号为SEQ ID N0:6的MAP、序列号为SEQ ID N0:7的 MPGa、序列号为SEQ ID N0:8的M918、序列号为SEQ ID N0:9的R6Pen、序列号为SEQ ID NO: 10的penetratin、序列号为SEQIDN0:ll的P印-1-K、序列号为SEQIDN0:12的ARFl-22、序 列号为SEQIDN0:13的Tpl0、序列号为SEQIDN0:14的P0D、3-100个赖氨酸残基组成的聚 赖氨酸以及4~9个精氨酸残基组成的聚精氨酸;优选聚精氨酸为8个精氨酸残基组成的聚 精氨酸R8。
[0022] 进一步地，核酸药物包括核苷酸单体或寡聚核苷酸，优选寡聚核苷酸为非取代的 寡核苷酸或取代的寡核苷酸，取代的寡核苷酸为磷酰二胺吗啉代寡核苷酸，非取代的寡核 苷酸选自锁核酸、s i RNA、mircoRNA、核酸适体、肽核酸、诱骗0DN、催化性RNA以及CpG二核苷 酸中的任意一种;更优选寡聚核苷酸为长度为19~23bp的siRNA。
[0023] 进一步地，19-23bp的siRNA为SEQIDN0:17至SEQIDN0:172中的任意一种。
[0024] 根据本发明的另一方面，提供了一种上述任一种核酸偶联物在体外筛选药物中的 应用。
[0025]应用本发明的技术方案，核酸偶联物通过柔性链段连接核酸药物和穿膜肽，柔性 链段能够在物理空间上间隔核酸药物和穿膜肽，进而阻止强电负性的核酸药物与呈正电性 的穿膜肽之间相互吸引形成发夹结构，从而避免了核酸药物与穿膜肽间因静电作用而发生 聚集沉淀的问题，使得核酸药物进入细胞后能够在细胞质或细胞核内发挥其生物活性，提 高其生物利用度。
【附图说明】
[0026]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0027]图1示出了本发明的核酸偶联物CPP-PEG-siRNA的结构示意图；
[0028]图2示出了本发明的一种优选实施例中核酸偶联物的合成路线图；
[0029]图3示出了本发明一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA的 琼脂糖凝胶电泳结果，泳道1为核酸标准物(Marker)，泳道2为siRNA，泳道3为LMWP-PEG，泳 道4 为 LMWP-PEG-S-S-siRNA，泳道 5 为 siRNA 的二聚体，泳道6 为 LMWP-PEG-S-S-siRNA 用谷胱 甘肽还原后的siRNA;
[0030]图4A至图4E示出了本发明一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-s iRNA的质谱表征结果;其中，图4A示出了 LMWP的分子量；图4B示出了 NHS-PEG-Ma 1的分子量 分布；图4C示出了LMWP与PEG共价偶联后形成的LMWP-PEG分子量分布；图4D示出了Μ0Ε的分 子量;图4E示出了 LMWP-PEG-S-S-MOE的分子量分布；
[0031] 图5A示出了本发明一种优选实施例中所制备的核酸偶联物LMWP-PEG-S-S-siRNA 与现有技术制备的药物经激光扫描共聚焦显微镜(Confocol)观察到的在MDA-MB-231细胞 中的摄取比对情况;其中，1代表roS缓冲液的空白对照组;2代表不含有任何转染试剂的裸 siRNA组;3代表脂质体包裹的siRNA复合体;4代表LMWP-PEG与siRNA按摩尔比1:1混合的物 理共混物;5代表LMW