一种用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜及其制备方法和应用与流程

本发明属于静电纺纳米纤维材料领域，特别涉及一种用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜及其制备方法和应用。

背景技术：

近年研究表明，基于循环肿瘤细胞(circulatingtumorcells,ctcs)的液体活检技术有望成为一种全新的肿瘤早期检测技术。由于ctcs在血液中数量非常少，10⁹个血细胞中仅含有1～100个ctcs，要在众多血细胞中分离出稀少的ctcs细胞颇具难度，成为ctcs研究的主要阻碍。因此ctcs研究的关键在于从含有大量血细胞的复杂血液样本中准确、高效地将其分选出来。通过改进分离技术和设备，满足高捕获率、高纯度和高通量的要求，从而成为能够满足科研和临床需求的工具。

纳米材料由于其尺寸较小(1-100nm)，具有特殊的光学、电子学和磁学等性质，能够有效地应用于各种医学研究。静电纺丝是一种可以快速简便制备具有高比表面积的纳米或微米级纤维的生产技术，该方法具有以下特点：制备过程简易、纤维种类多样；所制得的纳米纤维具有极大的比表面积，能提供大量的细胞接触位点，使单位面积内捕获细胞的数量增加[chen,l.,etal.,aptamer-mediatedefficientcaptureandreleaseoftlymphocytesonnanostructuredsurfaces.advancedmaterials,2011,23,4376-4380]。大量研究表明纳米纤维易进行表面修饰，并且可以负载生物活性分子，如蛋白质、核酸、糖类及生长因子等。同时，纳米纤维能够模拟天然细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)，为细胞的粘附、增殖及生理功能提供良好的微环境。

目前，应用抗体修饰的纳米纤维膜捕获ctcs的平台受到研究者的青睐，利用功能化纳米纤维对细胞进行捕获的报道也越来越多。武汉大学zhang等[zhang,n.,etal.,electrospuntio2nanofiber-basedcellcaptureassayfordetectingcirculatingtumorcellsfromcolorectalandgastriccancerpatients.advancedmaterials,2012,24,2756-2760]利用功能化二氧化钛纳米电纺丝包被基底，实现对血液中ctcs的分离富集。除了功能化识别抗体，基底沉积的电纺丝平行排列，其拓扑结构与细胞外基质相互作用，以提高ctc捕获率。研究表明，细胞表面纳米结构组件(微绒毛和丝状伪足)与细胞外基质相互作用，影响细胞黏附、活性迁移及分化等功能。因而可以通过纳米材料模拟细胞外基质构建一些可调控细胞黏附性的纳米表面，实现对ctc的捕获。

由于微流控芯片管道尺寸在微米量级和细胞尺寸非常匹配，又可以很好地操纵流体，非常适合应用于细胞分选。而且，分选ctcs的样品非常有限，使用微流控芯片处理微量流体正好弥补了这一缺陷，所以受到研究者的普遍关注。近些年来，有越来越多的研究者将微流控芯片技术应用在ctcs的分选上。

将纳米材料与微流控芯片相结合，可以进一步提高细胞与捕获靶点的接触，从而解决临床检测中待处理血样量少以及单一使用微流控芯片时富集灵敏度较低等问题。zhao等人[zhao,l.,etal.,high-purityprostatecirculatingtumorcellisolationbyapolymernanofiber-embeddedmicrochipforwholeexomesequencing.advmater,2013.25(21):p.2897-2902]构建表面具有epcam特异性抗体修饰的微流控芯片，通过控制微流通道长度，通道内液体流速等因素，增加了细胞表面识别探针与细胞的接触，进一步提高了ctc的捕获灵敏度。并且该基底可以实现单细胞的显微切割，并对获得的ctcs进行全基因测序，显示出很好的效果。然而，epcam抗体只能捕获上皮来源的癌细胞，且价格昂贵、不易保存，具有很大的应用局限性。

叶酸作为一种人体内不可缺少的维生素，具有非常重要的生物学意义。近年来的研究表明，叶酸受体在上皮以及非上皮来源的恶性肿瘤细胞表面高表达，叶酸(folicacid,fa)配体及叶酸类似物与叶酸受体(fr)之间具有很强的特异性和亲和力，远高于抗体与受体之间的亲和力，因而叶酸偶联物常作为靶向诊断试剂检测fr阳性表达的肿瘤。格诺思博公司使用叶酸修饰的核酸分子探针作为靶向试剂，利用靶向pcr技术来检测癌症患者血液中的ctc水平，作为非小细胞肺癌ct诊断的辅助手段，使得诊断的准确率大大提高，目前已经获得cfda认证，在肺癌的早期诊断中取得较好的效果。与抗体修饰的纳米纤维相比，叶酸功能化的纳米纤维黏附力强，价格低廉，便于存储和运输，所以诸如叶酸类的非抗体靶向分子在未来的体外诊断领域具有非常重要的商业价值。微流控芯片可以在微米级尺度操控流体，在细胞捕获中具有极大的优势，在动态条件下进行ctcs的捕获，有利于实现过程的自动化和工业化。

检索国内外相关文献和专利结果表明：叶酸修饰的纳米纤维捕获叶酸受体高表达细胞并结合微流控芯片技术进行细胞捕获的技术，尚未见报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜及其制备方法和应用，该纳米纤维膜采用叶酸靶向修饰，结合纳米纤维的大比表面积和微流控芯片技术对细胞及流体精确操作的优点，确保了高捕获率，材料稳定性好，使用方便，制作简单，成本低廉，具有很好的应用前景。

本发明提供了一种用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜，所述纳米纤维膜为叶酸修饰的聚乳酸-羟基乙酸plga纳米纤维膜；其中，所述叶酸预先连接在多氨基化合物表面。

所述多氨基化合物为聚乙烯亚胺pei。

所述修饰时采用edc/nhs进行交联。

所述纳米纤维膜中的纤维直径在10nm～2000nm之间。

本发明还提供了一种用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜的制备方法，包括：

(1)将聚乳酸-羟基乙酸plga溶于有机溶剂中，搅拌得到纺丝液；随后进行静电纺丝，干燥，得到plga纳米纤维膜；

(2)将叶酸溶于有机溶剂中，经edc/nhs活化后和pei反应2-3天，透析，冷冻干燥得到pei-fa(如图1c所示)；其中，叶酸、edc、nhs和pei的质量比为4-8:20-50:10-20:200-500；

(3)采用edc/nhs活化步骤(1)得到的plga纳米纤维膜，浸入超纯水中，随后加入pei-fa的水溶液，反应2-3d后将纤维膜取出，浸入超纯水中清洗，干燥，即得用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜(如图1d所示)；其中，plga纳米纤维膜、edc、nhs和pei-fa的质量比为100:90-96:50-60:2-10。

所述步骤(1)中的plga和有机溶剂的质量体积比为1g:4ml；plga的mw为80,000。

所述步骤(1)中的有机溶剂为体积比3:1的四氢呋喃和n,n-二甲基甲酰胺的混合溶液；所述步骤(2)中的有机溶剂为二甲基亚砜dmso。

所述步骤(1)中的静电纺丝工艺参数为：温度20-35℃，电压为15-20kv，接收距离为15cm，流速为0.3ml/h，环境湿度为40-50％，接收于标准载玻片或直径14mm的圆形盖玻片上。

所述步骤(1)中的干燥为自然风干，干燥时间为12-24h。

所述步骤(2)中的pei使用异硫氰酸荧光素fitc或其它荧光染料标记，便于检测。

所述步骤(2)中的edc/nhs活化时间为2-3h。

所述步骤(3)中的pei-fa的水溶液的浓度为1～2mg/ml。

本发明还提供了一种用于捕获叶酸受体高表达癌细胞的纳米纤维膜的应用，所述纳米纤维膜结合微流控芯片进行叶酸受体高表达癌细胞的特异性捕获。

所述微流控芯片包括：由玻璃基底、盖层组成的细胞捕获通道，细胞捕获通道的一端为样品注入口，另一端为样品出口，盖层具有椭圆柱阵列，纳米纤维膜夹于玻璃基底和盖层中间形成三明治结构，通过外置夹板固定和密封通道。

本发明的纳米纤维膜包埋入微流控芯片内部的方法包括：

(1)纳米纤维膜直接接收于玻璃基底或pdms基底表面；

(2)纳米纤维膜键合时按照长28mm、宽8mm的尺寸用手术刀裁切，多余部分用手术刀轻轻刮掉，再用酒精擦拭干净，干燥。

(3)为避免压力过大而导致的液体泄漏，微流控芯尽可能而非必须的用夹具固定。

捕获肿瘤细胞的方法包括：

(1)将靶向细胞进行荧光染色，然后用细胞培养液进行重悬浮；

(2)先用磷酸盐缓冲液(pbs)将芯片内充满，再将血液样品注入微流控芯片的细胞捕获通道内，再用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗；

(3)在捕获通道内，由于纤维表面修饰有大量的叶酸，可以靶向捕获叶酸受体过表达的癌细胞。当癌细胞从纤维表面流过时，靶向细胞会被捕获，粘附在纤维表面，非靶向细胞随着流体流出通道；

(4)在荧光显微镜下观察捕获区域，可以检测出捕获到的靶向细胞并进行计数。

有益效果

(1)本发明采用静电纺技术制备纳米纤维膜，可以实现fa的简便快捷修饰，还可以实现包埋，如微流控芯片内部；

(2)本发明采用叶酸修饰的plga静电纺纳米纤维膜可以实现人口腔上皮癌细胞(kbcell)的特异性捕获；

(3)本发明采用叶酸靶向修饰，结合纳米纤维的大比表面积和微流控芯片技术对细胞及流体精确操作的优点，确保了高捕获率，材料稳定性好，使用方便，制作简单，成本低廉，具有很好的应用前景。

附图说明

图1a-d为本发明功能化纳米纤维的合成示意图；

图2为本发明制备的plga静电纺纳米纤维的sem图(左)及直径分布图(右)；

图3为本发明制备的pei-fi溶液的紫外-可见吸收光谱图(左)和pei-fi修饰的功能化后纳米纤维的荧光显微镜图(右)；

图4为本发明制备的plga静电纺纳米纤维(3)，经过pei修饰后的plga纳米纤维(2)和经过pei、fa修饰后的plga纳米纤维(1)的红外光谱图；

图5为本发明制备的fa修饰的plga静电纺纳米纤维在不同时间内(10min、30min、50min、70min)对fa受体高表达细胞(kb细胞)(左)和低表达细胞(l929细胞)(右)捕获的效率；

图6为本发明组装的包埋纳米纤维的用于癌细胞捕获的微流控芯片装置图；

图7为不同流速条件下包埋纳米纤维的微流控芯片用于癌细胞捕获的情况；

图8为本发明纳米纤维膜的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

称取2.0g的plga，将其溶于thf和dmf的混合溶剂(thf(四氢呋喃)和dmf(n-n-二甲基甲酰胺)的体积比为3:1)中，在磁力搅拌作用下，直到plga全部溶解完毕，得到纺丝液浓度为25％(1g/4ml)。然后把纺丝液吸取到注射器内，利用高压静电纺丝机进行静电纺丝，纺丝条件为：温度25℃，湿度40-50％，电压20kv；接收距离15cm；液体流量0.3ml/h。其中接收板为干净的载玻片或者粘附在载玻片上的圆形盖玻片。放入通风橱中干燥12-24h。扫描电子显微镜(scanningeelectronmicroscope,sem)结果显示，获得的纳米纤维表面光滑，直径均匀，纤维平均直径为850.2nm(图2)。

然后把fa修饰到pei表面，将4.41mg的fa溶解于5ml的二甲基亚砜dmso中，使用超声约30min使其完全溶解，然后在磁力搅拌下逐滴加入1mledc水溶液28.7mg，反应30min后再加入1mlnhs水溶液16.4mg，使用磁力搅拌仪搅拌2.5h，充分活化叶酸羧基基团。然后加入5mlpei的二甲基亚砜溶液(250mg)，在磁力搅拌条件下反应2～4天，最后透析，除去游离的fa，冷冻干燥后备用。

先将纺有plga纳米纤维(100mg)的载玻片或者盖玻片置于染色架上，然后完全浸没在装有超纯水的染色缸中，加入5mledc(95.8mg)水溶液，在磁力搅拌条件下反应30min，然后加入5mlnhs(57.9mg)水溶液，在常温下和磁力搅拌条件下活化纳米纤维膜羧基2.5h，最后加入10mlpei-fa13mg水溶液于染色缸中，使用磁力搅拌仪搅拌2～3d。反应完成后，将染色架置于超纯水的溶液中，在磁力搅拌条件下浸泡三小时清洗除去游离的pei，每小时换水一次。洗去游离的pei-fa，真空干燥后放置于低温处备用。图3的紫外光谱图和荧光显微镜图验证了pei可以成功修饰到纳米纤维表面，图4的红外光谱图进一步表明聚乙烯亚胺-叶酸(pei-fa)可以修饰到纳米纤维表面。

实施例2

为了验证纤维材料具有特异性的捕获效果，以具有叶酸受体高表达的人口腔上皮细胞(kb细胞)为模型细胞来检验制备的fa修饰的功能化纳米纤维特异性捕获kb细胞的效果。

将获得fa修饰好的覆盖纳米纤维的圆形盖玻片从载玻片取下，然后将样品放入12孔培养板。不同时间点的样品放置在不同的培养板中，每个样品3个平行样。紫外照射1h后，在孔板中加入400μl无血清培养基浸泡纤维玻片30min。然后吸出培养基，将准备好的无血清细胞悬液加入到孔板中，细胞浓度为250个/ml，悬液加量为400μl，保证每个孔板中加入的细胞为100个。然后静置10、20、40、60min，随后取出培养基，并用pbs清洗三次，利用活细胞染料钙黄绿素染色，在荧光显微镜下观察计数。然后统计细胞捕获效率。对照组采用l929细胞(叶酸受体低表达的细胞)，采用上述同样条件处理。由图中可知功能化修饰的纳米纤维和无修饰的plga纳米纤维对kb细胞的捕获效率具有显著性差异，并且对照左右图可知功能化纳米纤维对叶酸受体高表达细胞的捕获效率明显高于低表达细胞(图5)。

实施例3

制备聚二甲基硅氧烷(pdms)芯片(如图6所示)：将预聚体与固化剂以质量比10：1比例混合均匀，真空除气泡，将pdms溶液倒入放置有硅片模具的培养皿内，于60℃烘箱固化。将修饰叶酸的plga纳米纤维膜切割成和芯片细胞捕获通道相近的大小，然后将裁切好纳米纤维膜的载玻片与微流控芯片一同进行离子处理。其中，覆有纳米纤维膜的载玻片只处理玻璃表面，纤维膜使用稍大的pdms膜进行临时遮挡，防止等离子对纤维膜的破坏。处理后迅速在一定压力下将二者键合。将键合后的装置包入密封膜防止污染，避光保存。细胞捕获实验前利用环氧树脂ab胶在通道入口和出口粘上医用输液管，并用夹具夹住封装好的芯片，降低渗漏风险。

微流控芯片捕获循环肿瘤细胞：

步骤a：将kb细胞用胰酶消化后悬浮，1000rpm离心除去胰酶，再用无血清培养基悬浮，然后在培养基内加入钙黄绿素活细胞荧光染料，37℃条件下避光染色30min，离心除去染色液，再用pbs清洗两次，最后再利用无血清培养基悬浮细胞，计数后分别取含125、250、500个kb细胞的悬液10μl；

步骤b：先用磷酸盐缓冲液(pbs)将芯片内充满，再将制备好的混合细胞悬液1ml注入微流控芯片的纤维靶向捕获通道内，流速大约为1-5ml/h，然后再用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗；

步骤c：在捕获通道内，由于纤维表面修饰有大量的叶酸，可以靶向捕获叶酸受体过度表达的癌细胞，当细胞从纤维表面流过时，细胞在纤维膜表面流动，靶向细胞会被捕获，粘附在纤维表面，非靶向细胞随着流体流出通道，流入到储液池，受重力作用沉积在底部；

步骤d：在荧光显微镜下检测捕获区域，可以检测出捕获到的靶向细胞。统计后发现流速为1ml/h时该芯片获得kb细胞最大捕获效率达92％以上(图7)。