一种双层杂化纳米纤维膜的制备方法

1.本发明属于生物医用材料技术领域，尤其是涉及涉及一种双层杂化纳米纤维膜的制备方法。


背景技术：

2.皮肤是人体的主要器官，是环境和身体之间的屏障。据美国国家健康中心的数据统计结果显示，人类的皮肤伤口问题已经成为一种迅速增长的公共卫生危害。以烧伤造成的皮肤损伤为例，全球每年因火灾和高温烧伤导致3500万人受伤，290万人住院治疗，23.8万人死亡。创面愈合过程需要敷料覆盖，保护伤口免受感染并期望可以促进愈合。
3.近年来现代生物技术的迅速发展，医药领域发生了重大变革。随着对创面愈合过程的深入了解，医用敷料也逐步更新换代。现存敷料有传统棉垫、纱布类，药用性敷料如常见的创可贴，以及合成类敷料等。然而这些敷料大多存在易粘连，对伤口造成二次伤害、透气性和抗菌性无法兼顾、价格昂贵等问题，所以近年来对来源广、生物相容性良好的天然类敷料的研究日益增多。天然类敷料是用海藻酸盐、壳聚糖、纤维素、胶原等原料制的，其中的胶原是人类真皮层的主要成分，具有独特的生物特性，因此十分适用于创面敷料。
4.目前看来，制备双层敷料的方法已有报道，中国专利文献cn114191599a公布了一种水凝胶/纳米纤维仿生双层敷料，该产品通过低压抽滤的方式将部分水凝胶嵌入到纳米纤维的多孔结构中，无需其他步骤就增强了界面结合。中国专利文献cn105056279a公布了一种复合胶原的聚氨酯基双层敷料，通过内层的泡沫敷料与外层的薄膜结合，可以降低敷料更换频率以及患者的疼痛感。还有通过上下两层对水亲和力不用的特点，设计的自泵导湿型双层敷料，可以将创面多余的组织液排到敷料表面，而不会污染伤口(zhangx,lvr,chenl,etal.amultifunctionaljanuselectrospunnanofiberdressingwithbiofluiddraining,monitoring,andantibacterialpropertiesforwoundhealing.acsappl.mater.interfaces2022,14,11,12984
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13000)。
5.由此可以看出，设计不对称的双层乃至多层敷料，更贴近人体皮肤结构，已逐渐成为研究的热点。但是以上技术多为海绵、水凝胶为主体制备双层材料，需要较长、较复杂的过程。此外，现存敷料中的功能成分多为抗生素类药物，耐药性问题日益严重，而无机纳米粒子大多毒性低、生物安全性高，值得作为功能材料加以使用。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种制备双层杂化纳米纤维膜的方法。该方法是以胶原为原料，添加无机纳米颗粒，然后通过静电纺丝法制备双层杂化纤维膜材料。其中第一层纤维膜为水溶性，遇到创面组织液后可以迅速溶解，释放生物活性物质促进伤口愈合；第二层为亲水性材料，保持伤口创面湿润的同时可以释放功能性材料，并到缓释作用。
7.为解决上述第一个技术问题，本发明采用如下的技术方案：
8.一种双层杂化纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
9.1)将水溶性助纺剂溶于水中，与胶原水解液混合均匀，得到第一层水溶性纺丝液，然后将混合液通过静电纺丝技术制得第一层水溶性纤维膜；
10.2)将疏水性可纺物质和明胶溶解在乙酸溶液中搅拌均匀，得到第二层亲水性纺丝液；
11.3)在第一层水溶性纤维膜的基础上将第二层亲水性纺丝液通过静电纺丝技术进行纺丝得到双层纳米纤维膜，得到双层杂化纳米纤维膜。
12.作为一种实施方式，步骤1)中，在第一层水溶性纺丝液中掺杂无机纳米颗粒；优选地，所述无机纳米颗粒选自氧化锌纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、氟化钙纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒中的一种或多种。
13.作为一种实施方式，步骤1)中，所述胶原水解液是动物皮革经过粉碎、水解、浓缩得到的，胶原以多肽形式溶解在水中。
14.作为一种实施方式，步骤1)中，所述水溶性助纺剂选自聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
15.作为一种实施方式，步骤1)中，所述水溶性助纺剂的质量浓度为5～20％，溶于水中的温度为50～80℃；所述水溶性助纺剂和胶原水解液的质量比为1-2:1。
16.作为一种实施方式，步骤1)中，所述静电纺丝技术的工艺参数为：电压15-25kv，接受距离18-22cm，纺丝液进料速率0.001-0.01ml/min；纺丝环境条件温度为30
±
5℃，湿度为48
±
5％。
17.作为一种实施方式，步骤2)中，在第二层亲水性纺丝液中掺杂无机纳米颗粒；优选地，所述无机纳米颗粒选自氧化锌纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、氟化钙纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒中的一种或多种。
18.作为一种实施方式，步骤2)中，所述疏水性可纺物质选自聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种。
19.作为一种实施方式，步骤2)中，所述疏水性可纺物质和明胶的总重量分数为 10-30％；所述疏水性可纺物质和明胶的质量比为1-2:2-1，乙酸的重量浓度为75-85％。
20.作为一种实施方式，步骤3)中，所述静电纺丝技术的工艺参数为：电压15-25kv，接受距离18-22cm，纺丝液进料速率0.001-0.01ml/min；纺丝环境条件温度为30
±
5℃，湿度为48
±
5％。
21.本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
22.如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。
23.与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
24.1、本发明设计双层膜结构：第一层纤维膜为水溶性，遇到创面组织液后可以迅速溶解，释放具有生物活性的物质，有利于伤口愈合；第二层为亲水性材料，保持伤口创面湿润的同时可以释放功能性材料，并到缓释作用。
25.2、有机-无机杂化可以减少细胞的抗药性，无机纳米颗粒还可以补充人体的微量元素；
26.3、利用静电纺丝技术制备纳米纤维膜，工艺简单，材料微观结构类似细胞外基质，
有助于细胞生长。
附图说明
27.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明
28.图1为本发明的胶原水解液的扫描电镜图；
29.图2为本发明实施例1产品的扫描电镜图；其中a为第一层的平面结构，b为第二层的平面结构，c为双层的截面结构；
30.图3为本发明实施例2产品的扫描电镜图；其中a为第一层的平面结构，b为第二层的平面结构，c为双层的截面结构；
31.图4为本发明实施例2产品的透射电镜图；其中a为第一层纤维的透射图，b为第二层纤维的透射图；
32.图5为本发明实施例1产品的水接触角照片：其中a为第一层的水接触角照片， b为第二层的水接触角照片；
33.图6为本发明实施例1产品的应力-应变曲线；
34.图7为本发明实施例2产品的应力-应变曲线；
35.图8为本发明实施例1产品的细胞实验柱状图；
36.图9为本发明实施例2产品的细胞实验柱状图；
37.图10为本发明实施例3产品第二层纤维膜的扫描电镜图；
38.图11为本发明实施例3产品第二层纤维膜的透射电镜图；
39.图12为本发明实施例4产品第二层纤维膜的扫描电镜图；
40.图13为本发明对比例2产品的扫描电镜图；
41.图14为本发明对比例3产品的水接触角照片。
具体实施方式
42.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
43.作为本发明的一个方面，本发明一种双层杂化纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
44.1)将水溶性助纺剂溶于水中，与胶原水解液混合均匀，得到第一层水溶性纺丝液，然后将混合液通过静电纺丝技术制得第一层水溶性纤维膜；
45.2)将疏水性可纺物质和明胶溶解在乙酸溶液中搅拌均匀，得到第二层亲水性纺丝液；
46.3)在第一层水溶性纤维膜的基础上将第二层亲水性纺丝液通过静电纺丝技术进行纺丝得到双层纳米纤维膜，得到双层杂化纳米纤维膜。
47.本发明中，所述术语“杂化”是指对无机和有机材料在宏观尺度上进行复合，以期改进单一材料在性能方面的缺乏。
48.在某些实施例中，步骤1)中，在第一层水溶性纺丝液中掺杂无机纳米颗粒；优选地，所述无机纳米颗粒选自氧化锌纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、氟化
钙纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒中的一种或多种。
49.在某些实施例中，步骤1)中，所述胶原水解液是动物皮革经过粉碎、水解、浓缩得到的，胶原以多肽形式溶解在水中。
50.在某些实施例中，步骤1)中，所述水溶性助纺剂选自聚乙烯醇、聚氧化乙烯、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
51.在某些实施例中，步骤1)中，所述水溶性助纺剂的质量浓度为5～20％，溶于水中的温度为50～80℃；所述水溶性助纺剂和胶原水解液的质量比为1-2:1。
52.在某些实施例中，步骤1)中，所述静电纺丝技术的工艺参数为：电压15-25kv，接受距离18-22cm，纺丝液进料速率0.001-0.01ml/min；纺丝环境条件温度为30
±
5℃，湿度为48
±
5％。
53.在某些实施例中，步骤2)中，在第二层亲水性纺丝液中掺杂无机纳米颗粒；优选地，所述无机纳米颗粒选自氧化锌纳米颗粒、二氧化钛纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、氟化钙纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化铜纳米颗粒中的一种或多种。
54.在某些实施例中，步骤2)中，所述疏水性可纺物质选自聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的一种或多种。
55.在某些实施例中，步骤2)中，所述疏水性可纺物质和明胶的总重量分数为 10-30％；所述疏水性可纺物质和明胶的质量比为1-2:2-1，乙酸的重量浓度为75-85％。本发明中，将疏水性可纺物质和明胶混合溶解在乙酸中后，在前述比例时，使得纺丝液呈亲水性，而不是疏水性。
56.在某些实施例中，步骤3)中，所述静电纺丝技术的工艺参数为：电压15-25kv，接受距离18-22cm，纺丝液进料速率0.001-0.01ml/min；纺丝环境条件温度为30
±
5℃，湿度为48
±
5％。
57.实施例1
58.一种双层纳米纤维膜及其制备方法，包括如下步骤：
59.1)将动物皮革粉碎、水解、浓缩得到的胶原水解液；
60.a.将原料皮革清洗烘干后，用粉碎机粉碎；
61.b.分别称取氢氧化钠3.5g、尿素6g、水40.5g于烧杯中混合，搅拌均匀制备碱尿素溶液；
62.c.称取2g处理过的皮屑与40ml碱尿素溶液混合，35℃下搅拌5小时得到胶原水解液；
63.d.量取4.2ml冰乙酸溶液调节胶原水解液至中性。使用离心机10000转/min离心12分钟，将上清液倒入截留分子量为1000的透析袋中与去离子水透析72小时除去盐类杂质；将透析液在50℃下减压旋蒸4.5h得约15g含有小分子多肽的胶原水解液；
64.2)称取0.6g聚乙烯醇(1788型)加入2.4g去离子水中，在50℃下搅拌溶解1.5 小时，配制质量分数20％的pva溶液；
65.3)称取3g步骤1)中的水解液与步骤2)中配制的20％pva溶液混合，搅拌均匀后，超声15min得到第一层水溶性纤维膜；
66.4)纺丝条件：工艺参数：电压20kv，接收距离21cm，进料速率0.004ml/min；环境条件为温度30℃，湿度45％，纺丝6h可得第一层胶原蛋白/聚乙烯醇纳米纤维薄膜；
67.5)称取冰乙酸4g、水1g于烧杯中混合，配制质量浓度为80％的乙酸溶液；
68.6)分别称取聚己内酯0.294g、明胶0.588g，置于步骤5)配好的乙酸溶液中，搅拌过夜，得到聚己内酯和明胶总质量分数为15％，质量比为1:2的第二层亲水性纺丝液；
69.7)纺丝条件：工艺参数：电压20kv，接受距离21cm，进料速率0.004ml/min；纺丝环境条件为温度30℃，湿度43％，在第一层纤维膜上继续纺丝5.5h得到双层胶原基纳米纤维膜。
70.经测试，参见图1所示，本实施例得到的双层纳米纤维膜厚度0.067mm，弹性模量43.43mpa，拉伸强度2.02mpa，应力-应变曲线如图6所示，具有良好的力学性能。本实施例产品的细胞实验柱状图，如图8所示，无论是单层材料还是双层纳米纤维膜，均无细胞毒性，生物相容性良好；细胞存活率甚至大于100％，有促增殖作用，原因为：胶原水解液和明胶均为胶原类材料，具有生物活性，其中的胶原水解液经过系列处理后变为小分子多肽和氨基酸，作为类似生长因子的营养成分促进细胞生长。因此，该产品有望应用于创面敷料方向，促进伤口愈合。
71.实施例2
72.一种双层杂化纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
73.1)将动物皮革粉碎、水解、浓缩得到的胶原水解液；
74.a.将原料皮革清洗烘干后，用粉碎机粉碎；
75.b.分别称取氢氧化钠3.5g、尿素6g、水40.5g于烧杯中混合，搅拌均匀制备碱尿素溶液；
76.c.称取2g处理过的皮屑与40ml碱尿素溶液混合，35℃下搅拌5小时得到胶原水解液；
77.d.量取4.2ml冰乙酸溶液调节胶原水解液至中性。使用离心机10000转/min离心12分钟，将上清液倒入截留分子量为1000的透析袋中与去离子水透析72小时除去盐类杂质。将透析液在50℃下减压旋蒸4.5h得约15g含有小分子多肽的胶原水解液；
78.2)称取0.6g聚乙烯醇(1788型)加入2.4g去离子水中，在50℃下搅拌溶解1.5 小时，配制质量分数20％的pva溶液；
79.3)称取13.2mg自制粒径为5-10nm的氧化锌纳米颗粒与3g步骤1)中的水解液混合，超声15分钟；
80.4)称取3g步骤1)中的水解液与步骤2)中配制的20％pva溶液混合，搅拌均匀后，超声15min得到第一层水溶性纤维膜；
81.5)纺丝条件：工艺参数：电压20kv，接收距离21cm，进料速率0.004ml/min；环境条件为温度28℃，湿度45％，纺丝6h可得第一层胶原蛋白/聚乙烯醇-纳米氧化锌的杂化纤维薄膜；
82.6)称取冰乙酸4g、水1g于烧杯中混合，配制质量浓度为80％的乙酸溶液。
83.7)分别称取聚己内酯0.588g、明胶0.294g，置于步骤5)配好的乙酸溶液中，搅拌过夜，得到聚己内酯和明胶总质量分数为15％，质量比为2:1的纺丝液；
84.8)称取8.82mg粒径为5-10nm的二氧化钛纳米颗粒(锐钛矿型)与步骤7)中配置的溶液混合均匀，超声30min得到第二层亲水性纺丝液；
85.9)纺丝条件：工艺参数：电压20kv，接受距离21cm，进料速率0.004ml/min；纺丝环
境条件为温度28℃，湿度46％，在第一层纤维膜上继续纺丝5.5h得到双层胶原基/无机杂化纳米纤维膜；产品的扫描电镜图如图3所示；产品的应力-应变曲线如图7所示；产品的细胞实验柱状图如图9所示。
86.实施例3
87.一种双层杂化纳米纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
88.1)将动物皮革粉碎、水解、浓缩得到的胶原水解液；
89.a.将原料皮革清洗烘干后，用粉碎机粉碎；
90.b.分别称取氢氧化钠3.5g、尿素6g、水40.5g于烧杯中混合，搅拌均匀制备碱尿素溶液；
91.c.称取2g处理过的皮屑与40ml碱尿素溶液混合，35℃下搅拌5小时得到胶原水解液；
92.d.量取4.2ml冰乙酸溶液调节胶原水解液至中性。使用离心机10000转/min离心12分钟，将上清液倒入截留分子量为1000的透析袋中与去离子水透析72小时除去盐类杂质。将透析液在50℃下减压旋蒸4.5h得约15g含有小分子多肽的胶原水解液；
93.2)称取0.6g聚乙烯醇(1788型)加入2.4g去离子水中，在50℃下搅拌溶解1.5 小时，配制质量分数20％的pva溶液；
94.3)称取13.2mg自制粒径为5-10nm的氧化锌纳米颗粒与3g步骤1)中的水解液混合，超声15分钟；
95.4)称取3g步骤1)中的水解液与步骤2)中配制的20％pva溶液混合，搅拌均匀后，超声15min得到第一层水溶性纤维膜；
96.5)纺丝条件：工艺参数：电压20kv，接收距离21cm，进料速率0.004ml/min；环境条件为温度28℃，湿度45％，纺丝6h可得第一层胶原蛋白/聚乙烯醇-纳米氧化锌的杂化纤维薄膜；
97.6)称取冰乙酸4g、水1g于烧杯中混合，配制质量浓度为80％的乙酸溶液；
98.7)分别称取聚己内酯0.588g、明胶0.294g，置于步骤5)配好的乙酸溶液中，搅拌过夜，得到聚己内酯和明胶总质量分数为15％，质量比为2:1的纺丝液；
99.8)称取50mg粒径为15nm的二氧化硅纳米颗粒与步骤7)中配置的纺丝液混合均匀，超声30min得到第二层亲水性纺丝液；
100.9)纺丝条件：工艺参数：电压20kv，接受距离21cm，进料速率0.004ml/min；纺丝环境条件为温度28℃，湿度46％，在第一层纤维膜上继续纺丝5.5h得到双层胶原基/无机杂化纳米纤维膜。产品第二层纤维膜的扫描电镜图如图10所示；产品第二层纤维膜的透射电镜图如图11所示。
101.实施例4
102.重复实施例1，区别仅在于：
103.将第二层纺丝液中聚己内酯和明胶的总浓度改为20％，聚己内酯和明胶的质量比改为2:1；且步骤6)改为：分别称取聚己内酯0.833g、明胶0.417g，置于步骤5) 配好的乙酸溶液中，搅拌过夜，得到聚己内酯和明胶总质量分数为20％，质量比为 2:1的纺丝液，其他条件及具体操作步骤与实施例1完全一致。
104.图12为本实施例所得产品的第二层纤维膜的扫描电镜图，从图中可以看出第二层
的纤维连续且光滑。
105.对比例1
106.重复实施例1，区别仅在于：
107.将第一层纺丝液中胶原水解液与聚乙烯醇溶液的质量比改为3:1；且步骤3)改为：称取9g步骤1)中的水解液与步骤2)中配制的20％pva溶液混合，搅拌均匀后，超声15min得到第一层纤维膜的纺丝液。其他条件及具体操作步骤与实施例1 完全一致。
108.结果表明，由于纺丝液粘度太低，纺丝过程在针头处出现液体滴落现象，不能实现连续纺丝。
109.对比例2
110.重复实施例1，区别仅在于：
111.将第二层纺丝液中聚己内酯和明胶的总浓度改为10％，聚己内酯和明胶的质量比改为1:1；且步骤6)改为：分别称取聚己内酯0.278g、明胶0.278g，置于步骤5) 配好的乙酸溶液中，搅拌过夜，得到聚己内酯和明胶总质量分数为10％，质量比为 1:1的纺丝液，其他条件及具体操作步骤与实施例1完全一致。
112.结果表明，由于物质浓度和配比不适宜，纺丝过程纺丝液电喷，本对比例的产品扫描电镜图如图13所示，有大量珠状出现，无法纺丝形成纤维膜。
113.对比例3
114.重复实施例1，区别仅在于：第二层纺丝液中不添加明胶，即将第二层纺丝液中聚己内酯的总浓度改为15％，且步骤6)改为：分别称取聚己内酯0.278g，置于步骤 5)配好的乙酸溶液中，搅拌过夜，得到聚己内酯质量分数为15％的纺丝液，其他条件及具体操作步骤与实施例1完全一致。
115.结果表明，第二层纤维膜呈疏水性，如图14所示，水接触角大于90
°
，不利于为细胞提供黏附生长的环境。
116.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。