本发明涉及一种胶原纤维的制备方法，尤其涉及一种使用edc/nhs进行原位交联的胶原纤维的制备方法。
背景技术：
胶原作为细胞外不可或缺且具有水不溶性的纤维蛋白，是组成生物体细胞外基质(emc)的结构性蛋白质，其外观在一般呈现为白色、透明，不具有任何分支的原纤维。从外观来看，胶原大分子呈细长的棒状，能够溶于强酸或者强碱溶液，拥有极佳的保水性。作为给细胞提供弹性以及张力的胶原可以在细胞外基质中经过一系列反应形成半晶体的纤维，并且在细胞成长、迁移等过程中起到关键作用。从胶原的微观构造来说，胶原分子由3条α肽链组成。两条α肽链形成的二聚体肽链称β肽链，3条α肽链构成的三聚体肽链称为γ肽链，即原胶原分子。胶原分子中至少应该存在一个使胶原能够保留着天然活性的结构域(即胶原域)，这个结构域具有α链组成的三股螺旋构象，这也使胶原大分子轻易不被常见的蛋白酶所水解。i型胶原是动物体内含量最多的一类胶原，是脊椎动物结缔组织中最重要和最常见的胶原类型，其在组织工程领域的应用相当广泛。
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)是化学性质极为活泼的化合物，能使氨基和羟基之间形成酰胺键，既可以与加入胶原的羧基结合，也可以与其氨基结合，通常羧基与edc反应生成中间产物，再与另一分子的氨基反应而形成偶联物。n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)可促进上述反应形成更稳定的酯，增强edc交联产物的稳定性。将edc与nhs按一定比例混合制备交联剂，对胶原纤维进行交联改性，交联过程中并不作为连接分子的一部分残留在交联物中，而是转变成水溶性的脲衍生物释放出来。与醛类交联剂相比，edc/nhs既不会在生物材料内残留有毒物质，又具有良好的交联效果，因此是一种理想的交联剂。
作为一种重要的生物材料，胶原具有其他合成材料无可比拟的安全性，但其也存在不足的方面，如在体内降解过快，机械强度较低等。因此，在应用时需要采用适当的方法改性胶原，克服其应用的局限性。胶原的改性方法主要集中在共混改性和交联改性两个方面，其中化学交联改性是最有效的改性方法。现在已经报道的i型胶原纤维的化学改性方法是采用交联浴交联，其主要特点是将纺制成丝的胶原纤维浸泡在含有交联剂的交联浴中进行交联反应，从而达到提高胶原纤维强度的目的。然而交联浴交联的胶原纤维想要达到较高的交联度，通常需要较长的交联时间来使交联反应充分进行，其在工业化生产应用中存在一定的局限性。
综上，需要开发一种新型的交联方式来缩短胶原纤维的交联时间，改进胶原纤维成型工艺。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种原位交联的胶原纤维的制备方法。
本发明提供的原位交联的胶原纤维的制备方法，包括如下步骤：
(1)将edc与nhs按一定质量比混合，作为交联剂(edc质量分别为胶原蛋白质量的1-20％)溶于0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；
(2)将胶原蛋白溶于含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌，溶解过程中溶液温度维持在4-6℃之间，配成质量分数为1.5％的胶原溶液；
(3)将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液。采用湿法纺丝，注射泵挤出速度为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴中停留100-300s，得到胶原纤维，将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维。
上述制备方法中，步骤(1)所述edc与nhs按一定质量比混合，具体可分为2∶1、3∶1、4∶1；所述交联剂中edc的质量分别为胶原质量的1-20％，具体可为1％、5％、10％、15％、20％。
上述制备方法中，步骤(2)所述机械搅拌时间为8h-13h，具体可分为8h、9h、10h、11h、12h、13h。
上述制备方法中，步骤(3)所述凝固浴为丙酮、氨水和去离子水按照60∶1∶0.2的比例混合而成。
上述制备方法中，所述的胶原蛋白可以来源于鼠尾、牛皮或猪皮。优选地，胶原蛋白为来源于鼠尾、牛肌腱、牛皮或猪皮的再生胶原蛋白；更优选为i型再生胶原蛋白。这样有利于保证胶原蛋白纤维强度。
本发明所提供的制备方法，edc/nhs的存在提高了胶原纤维的结晶度和机械强度，原位交联缩短了胶原纤维的交联时间，改进了成形工艺条件。如在edc/nhs的质量分数为15％时，需要11h就可以同时完成溶解和交联过程，进入湿法纺丝步骤，进而缩短了整个制备工艺所需的时间。本发明所提供的方法制备的胶原纤维的直径为100μm-150μm，断裂强度为1.06cn/dtex-1.43cn/dtex，断裂伸长率为25％-50％。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面给出具体实施例详细说明本发明，但本发明的保护范围不受实施例的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明下述实施例中纤维力学性能采用如下方法进行测定：室温下，纤维测量长度为10mm，拉伸速率为10mm/min，结果取每种条件下10个样品的测量平均值。仪器：电子单纤维强力仪(莱州电子仪器有限公司)。
以下给出本发明的具体实施例。本发明不受具体实施例的限制。
实施例1：
将edc与nhs(edc质量为胶原蛋白质量的15％)按质量比3∶1混合，作为交联剂溶于20ml、0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；称取0.45g胶原蛋白(胶原蛋白为牛肌腱i型胶原蛋白，其分子量为300kda，紫外吸收峰为220-240nm，羟脯氨酸含量不小于9％)溶于上述含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌10h，溶解过程中溶液温度在4-6℃之间，配成质量浓度为1.5％的胶原溶液；将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液；采用湿法纺丝，注射泵挤出速度均为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴停留时间为100-300s，得到胶原纤维，并将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维，其直径为100μm-150μm，断裂强度为1.37cn/dtex。
实施例2：
将edc与nhs(edc质量为胶原蛋白质量的15％)按质量比3∶1混合，作为交联剂溶于20ml、0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；称取0.45g胶原蛋白(胶原蛋白为牛肌腱i型胶原蛋白，其分子量为300kda，紫外吸收峰为220-240nm，羟脯氨酸含量不小于9％)溶于上述含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌11h，溶解过程中溶液温度在4-6℃之间，配成质量浓度为1.5％的i型胶原溶液；将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液；采用湿法纺丝，注射泵挤出速度均为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴停留时间为100-300s，得到胶原纤维，并将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维，其直径为100μm-150μm，断裂强度为1.43cn/dtex。
实施例3：
将edc与nhs(edc质量为胶原蛋白质量的15％)按质量比3∶1混合，作为交联剂溶于20ml、0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；称取0.45g胶原蛋白(胶原蛋白为牛肌腱i型胶原蛋白，其分子量为300kda，紫外吸收峰为220-240nm，羟脯氨酸含量不小于9％)溶于上述含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌12h，溶解过程中溶液温度在4-6℃之间，配成质量浓度为1.5％的胶原溶液；将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液；采用湿法纺丝，注射泵挤出速度均为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴停留时间为100-300s，得到胶原纤维，并将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维，其直径为100μm-150μm，断裂强度为1.28cn/dtex。
实施例4：
将edc与nhs(edc质量为胶原蛋白质量的5％)按质量比3∶1混合，作为交联剂溶于20ml、0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；称取0.45g胶原蛋白(胶原为牛肌腱i型胶原蛋白，其分子量为300kda，紫外吸收峰为220-240nm，羟脯氨酸含量不小于9％)溶于上述含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌11h，溶解过程中溶液温度在4-6℃之间，配成质量浓度为1.5％的胶原溶液；将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液；采用湿法纺丝，注射泵挤出速度均为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴停留时间为100-300s，得到胶原纤维，并将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维，其直径为100μm-150μm，断裂强度为1.18cn/dtex。
实施例5：
将edc与nhs(edc质量为胶原蛋白质量的10％)按质量比3∶1混合，作为交联剂溶于20ml、0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；称取0.45g胶原蛋白(胶原蛋白为牛肌腱i型胶原蛋白，其分子量为300kda，紫外吸收峰为220-240nm，羟脯氨酸含量不小于9％)溶于上述含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌11h，溶解过程中溶液温度在4-6℃之间，配成质量浓度为1.5％的胶原溶液；将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液；采用湿法纺丝，注射泵挤出速度均为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴停留时间为100-300s，得到胶原纤维，并将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维，其直径为100μm-150μm，断裂强度为1.39cn/dtex。
实施例6：
将edc与nhs(edc质量为胶原蛋白质量的20％)按质量比3∶1混合，作为交联剂溶于20ml、0.5mol/l冰乙酸中形成含有交联剂的冰乙酸溶液；称取0.45g胶原蛋白(胶原蛋白为牛肌腱i型胶原蛋白，其分子量为300kda，紫外吸收峰为220-240nm，羟脯氨酸含量不小于9％)溶于上述含有交联剂的冰乙酸溶液中，使用机械搅拌充分搅拌11h，溶解过程中溶液温度在4-6℃之间，配成质量浓度为1.5％的胶原溶液；将胶原溶液在4℃下冷冻离心脱泡40min得到胶原纺丝原液；采用湿法纺丝，注射泵挤出速度均为0.5ml/min，初生纤维在凝固浴停留时间为100-300s，得到胶原纤维，并将出凝固浴的凝胶态胶原纤维加5g砝码悬挂，自然风干1h得到胶原纤维，其直径为100μm-150μm，断裂强度为1.29cn/dtex。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。