一种聚合物纳米纤维及其制备方法和应用

本发明涉及生物工程，特别涉及一种聚合物纳米纤维及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞球（spheroid）是一种三维的细胞聚集体结构，能够更好地模拟体内组织的结构和功能，已经被广泛应用于肿瘤研究、药物筛选、组织工程和毒理学等领域。

2、现有的细胞球的制备方法主要包括：（1）悬滴法：将细胞悬液以液滴形式（通常为10-50µl）滴在培养板盖子上，然后将盖子倒置，使液滴悬挂在盖子上，由于重力作用，细胞会逐渐沉降到液滴底部并相互聚集，最终形成细胞球，这种方法的关键在于液滴的稳定性和培养基的蒸发控制；（2）超低吸附培养法：利用经过特殊处理的培养板或培养皿，其表面具有超低吸附性，能够阻止细胞贴壁，从而促使细胞在悬浮状态下相互聚集形成细胞球，这种方法的关键在于优化细胞密度和培养时间，以确保细胞球的大小和形态符合实验需求；（3）旋转培养法：将细胞悬液置于旋转瓶中，通过持续搅拌使细胞保持悬浮状态并逐渐聚集形成细胞球；（4）微载体培养法：利用微载体（如明胶、琼脂糖或聚合物微球）作为细胞附着的支架，促进细胞聚集形成细胞球，微载体通常具有较大的比表面积，能够支持细胞的高密度生长；（5）气液界面法：将细胞接种于多孔膜上，在气液界面条件下培养，促进细胞聚集形成细胞球，这种方法的关键在于多孔膜的选择和培养条件的优化。

3、以上方法中，悬滴法操作简便，成本低，形成的细胞球大小均匀，但仅适合小规模实验和高通量筛选；超低吸附培养法操作简便，适合大规模培养，且细胞球形成效率高，但细胞球大小不均匀，且需要定期更换培养基以维持细胞活性；旋转培养法能够生成大量细胞球，且细胞球的大小可以通过调节搅拌速度来控制，但这种方法需要使用专用设备（如旋转瓶和搅拌器），且搅拌过程中产生的剪切力可能影响细胞活性；微载体培养法适用于大规模培养，且细胞球的大小和形态可以通过微载体的性质进行调控，但微载体可能影响细胞球的纯度和功能，且还需要优化微载体材料和细胞接种密度；气液界面法能够模拟某些组织的生理环境（如呼吸道、皮肤），促进细胞球的自然形成，但这种方法操作复杂，需要特殊设备，且需要优化实验条件以确保细胞活性。此外，细胞球的制备中还面临着以下挑战：对于较大直径的细胞球，在细胞球内部，随着距离表面距离的增加，氧气和营养物质的浓度逐渐降低，细胞的代谢活动受到限制，从而影响细胞的生存和功能，如已有研究表明直径大于500μm的细胞球，会因氧气和营养物质扩散困难，导致细胞球中心区域的细胞过早死亡。

4、因此，开发一种操作简单、成本低、易于控制、适合大规模培养，且能保证细胞内部氧气和营养物质正常扩散的细胞球的制备方法，对于促进细胞球在肿瘤研究、药物筛选、组织工程和毒理学等领域中的应用，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的之一在于提供一种聚合物纳米纤维。

2、本发明的目的之二在于提供这种聚合物纳米纤维的制备方法。

3、本发明的目的之三在于提供一种细胞球的制备方法。

4、本发明的目的之四在于提供一种细胞球。

5、本发明的目的之五在于提供这种细胞球的应用。

6、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

7、本发明的第一方面提供了一种聚合物纳米纤维，包括以下制备原料：明胶、交联剂、纳米增强相和溶剂；所述纳米增强相包括纳米羟基磷灰石（nhap）。

8、在本发明的一些实施方式中，所述聚合物纳米纤维的直径为550-650nm。

9、在本发明的一些具体实施例中，所述聚合物纳米纤维的直径为550-600nm。

10、在本发明的一些实施方式中，所述明胶的分子量为50-100kda。

11、在本发明的一些实施方式中，所述明胶和交联剂的质量比为(20-50): 1。

12、在本发明的一些实施方式中，所述明胶和纳米增强相的质量比为(10-60): 1。

13、在本发明的一些实施方式中，所述明胶和溶剂的固液比为1g: (5-30)ml。

14、在本发明的一些实施方式中，所述交联剂包括n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）中的至少一种。

15、在本发明的一些具体实施例中，所述明胶和n-(3-二甲氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为(25-50): 1。

16、在本发明的一些具体实施例中，所述明胶和n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为(20-30): 1。

17、本发明中，严格控制交联剂的用量，确保交联反应的充分性和稳定性的同时，避免因过量添加交联剂导致溶液变得过于粘稠，影响纤维的拉伸和形成。

18、在本发明的一些实施方式中，所述溶剂包括缓冲液和醇溶剂；所述缓冲液和醇溶剂的体积比为1: (0.5-5)。

19、在本发明的一些具体实施例中，所述缓冲液和醇溶剂的体积比为1: (0.5-4)。

20、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液包括pbs缓冲液。

21、在本发明的一些实施方式中，所述醇溶剂包括乙醇、异丙醇中的至少一种。

22、本发明的发明构思为：在天然骨骼中，羟基磷灰石（hap）与胶原蛋白的质量比为7:3，且天然骨中的羟基磷灰石为纳米尺寸，故以纳米羟基磷灰石为纳米增强相，以提供相应的生物活性；明胶是胶原蛋白的水解产物，包含着多个具有生物活性的官能团，与胶原不同的是，明胶可以溶解在水中，相对于胶原而言，明胶更易于塑形、成本更低，且具有良好的生物相容性，以及近于零的免疫原性，故本发明以明胶和纳米羟基磷灰石为主要原料，制备一种兼具两种原料特性的聚合物纳米纤维。

23、本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的聚合物纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：

24、s1、将明胶与溶剂混合，得到明胶溶液；

25、s2、向所述明胶溶液中加入交联剂，交联反应，得到交联明胶溶液；

26、s3、向所述交联明胶溶液中加入纳米增强相，分散，得到纺丝溶液，静电纺丝，得到所述的聚合物纳米纤维。

27、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述明胶溶液的ph为3.5-4.5。

28、在本发明的一些具体实施例中，步骤s1中，所述明胶溶液的ph为3.8-4.2。

29、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，包括添加ph调节剂调节所述明胶溶液的ph；所述ph调节剂的浓度为0.1-10mol/l。

30、在本发明的一些具体实施例中，所述ph调节剂包括乙酸。

31、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，包括先将缓冲液和醇溶剂搅拌混合，所述搅拌混合的转速为100-300rpm，时间为5-15min。

32、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述明胶与溶剂混合的过程辅以水浴加热，所述水浴加热的温度为40-50℃。

33、在本发明的一些实施方式中，步骤s1中，所述明胶与溶剂混合的过程辅以搅拌，所述搅拌的转速为200-500rpm。

34、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述交联反应的温度为25-35℃，时间为10-30min。

35、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述交联反应的过程辅以搅拌，所述搅拌的转速为100-300rpm。

36、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述分散的温度为25-35℃，时间为10-20min。

37、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述分散的过程辅以搅拌，所述搅拌的转速为200-500rpm。

38、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述静电纺丝的工艺参数包括以下参数中的至少一项：

39、1）环境温度为20-30℃；

40、2）相对湿度为40%-50%；

41、3）推注速度为0.10-0.15mm/min；

42、4）正电压为15-25kv，负电压为-2~-5kv；

43、5）纺丝距离为15-20cm；

44、6）收集装置转速为80-120rpm。

45、本发明中，需要严格控制静电纺丝的工艺参数，原因如下：①环境温度和湿度改变时，易导致纳米纤维呈现串珠状；②纺丝距离需要综合纺丝溶液的流动性和静电纺丝的效率进行设置，以避免纤维呈串珠状结构或断裂，当纺丝距离过近时，溶剂无法充分挥发，便会出现串珠状纳米纤维；③明胶溶液浓度增加时，会导致纤维变宽，浓度过高则可能直接导致纺丝失败；④推注速度过快易导致纤维断裂或不均匀，而过慢则易导致纤维直径增大或出现断点；⑤正负电压的设定，需要确保电压稳定且符合纺丝所需的静电场强度，较高的电压有助于拉伸溶液形成纤维，但过高的电压可能导致电弧放电或溶液喷溅；⑥收集装置的转速会影响纳米纤维收集的均匀性，设置不当，会造成纤维交叉或聚集。本发明通过对各参数进行控制，可有效提高纺丝溶液的稳定性和纤维的力学性能。

46、本发明的第三方面提供了一种细胞球的制备方法，包括采用培养基将本发明第一方面所述的聚合物纳米纤维配制成纳米纤维溶液，与细胞共培养，得到所述的细胞球。

47、在本发明的一些实施方式中，所述纳米纤维溶液的浓度为1-5mg/ml；所述纳米纤维溶液的用量为100-600个细胞/μl。

48、在本发明的一些具体实施例中，所述纳米纤维溶液的浓度为1-3mg/ml。

49、在本发明的一些实施方式中，所述培养基的组成包括400-500ml dmem/f12基础培养基、20-100ml胎牛血清和2-10ml青霉素-链霉素。

50、在本发明的一些实施方式中，所述共培养的时间为1-30d。

51、在本发明的一些具体实施例中，所述共培养的时间为1-20d。

52、在本发明的一些实施方式中，所述细胞选自干细胞、癌细胞、干细胞来源的心肌细胞、神经细胞、肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞、以及生物体来源的心肌细胞、神经细胞、肝细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞中的至少一种。

53、在本发明的一些具体实施例中，所述细胞包括骨髓间充质干细胞（bmscs）。

54、本发明的第四方面提供了一种细胞球，包括采用本发明第三方面所述的细胞球的制备方法制得。

55、本发明中，所得细胞球为聚合物纳米纤维增强细胞球，因聚合物纳米纤维为含有纳米增强相的明胶纳米纤维，明胶含有rgd序列（精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺酸），该序列能够很好的与细胞表面的整合素进行结合，进而上调细胞膜表面连接蛋白的表达，连接蛋白在细胞膜表面的积累可以增强邻近细胞之间的亲和力，加强细胞之间的连接，进而形成细胞球。此外，明胶纳米纤维具有较高的比表面积和结构稳定性，能够提供更多的支持和结构框架，从而更好地维持细胞球的稳定性。当以纳米羟基磷灰石为纳米增强相时，纳米羟基磷灰石本身良好的生物活性增强了聚合物纳米纤维对细胞的细胞活性，利于细胞与聚合物纳米纤维的聚集，且纳米羟基磷灰石的加入促使聚合物纳米纤维产生孔隙，进而促进氧气和营养物质扩散进入细胞球内部，使得细胞球中心区域的细胞不易因氧气和营养物质的缺失而过早死亡，利于细胞球的长期培养。

56、本发明的第五方面提供了本发明第四方面所述的细胞球在肿瘤研究、药物筛选、组织工程、毒理学研究中的应用。

57、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

58、1）本发明提供的聚合物纳米纤维，以明胶为主要原料，以包括纳米羟基磷灰石的物质为纳米增强相，所得聚合物纳米纤维具有生物相容性好、细胞活性高、比表面积大、有孔隙结构、结构稳定性好、成本低等特点，能够增强邻近细胞之间的亲和力，加强细胞之间的连接，促进细胞形成细胞球；

59、2）本发明提供的聚合物纳米纤维的制备方法，步骤简单、工艺条件温和，通过控制静电纺丝的工艺参数，即可提高纺丝溶液的稳定性和纤维的力学性能，得到均匀、外观好的聚合物纳米纤维；

60、3）本发明提供的细胞球的制备方法，将聚合物纳米纤维与细胞共培养，即可得到聚合物纳米纤维增强细胞球，操作简单、成本低、易于控制、适合大规模培养；

61、4）本发明提供的细胞球，成球速度快、结构稳定性好，氧气和营养物质可通过聚合物纳米纤维的孔隙向细胞球内部扩散，细胞球中心区域细胞不易过早死亡，且聚合物纳米纤维的加入，不会影响细胞的繁殖，能够满足肿瘤研究、药物筛选、组织工程、毒理学研究等对细胞球的应用需求。